Abschätzung von Urin-Nanokristallen beim Menschen mittels Calciumfluorophor-Markierung und Nanopartikel-Tracking-Analyse
Summary
Ziel dieser Studie war es, festzustellen, ob die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) Kalzium im Urin, die Nanokristalle von gesunden Erwachsenen enthält, nachweisen und quantifizieren kann. Die Ergebnisse der aktuellen Studie deuten darauf hin, dass NTA ein potenzielles Werkzeug zur Abschätzung von Urin-Nanokristallen während einer Nierensteinerkrankung sein könnte.
Abstract
Nierensteine werden weltweit bei Erwachsenen und Kindern immer häufiger. Die häufigste Art von Nierenstein besteht aus Calciumoxalat (CaOx) Kristallen. Kristallurie tritt auf, wenn Urin mit Mineralien (z. B. Kalzium, Oxalat, Phosphat) übersättigt wird und der Nierensteinbildung vorausgeht. Standardmethoden zur Beurteilung der Kristallurie in Steinbildnern umfassen Mikroskopie, Filtration und Zentrifugation. Diese Methoden detektieren jedoch in erster Linie Mikrokristalle und keine Nanokristalle. Es wurde angenommen, dass Nanokristalle für Nierenepithelzellen schädlicher sind als Mikrokristalle in vitro. Hier beschreiben wir die Fähigkeit der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), menschliche Harnnanokristalle nachzuweisen. Gesunde Erwachsene wurden mit einer kontrollierten Oxalatdiät gefüttert, bevor sie eine Oxalatladung tranken, um die Nanokristalle im Urin zu stimulieren. Urin wurde für 24 Stunden vor und nach der Oxalatbelastung gesammelt. Die Proben wurden verarbeitet und mit Ethanol gewaschen, um die Proben zu reinigen. Urin-Nanokristalle wurden mit dem calciumbindenden Fluorophor Fluo-4 AM gefärbt. Nach der Färbung wurden Größe und Anzahl der Nanokristalle mit NTA bestimmt. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass NTA Nanokristallurie bei gesunden Erwachsenen effizient nachweisen kann. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass NTA eine wertvolle Früherkennungsmethode für Nanokristallurie bei Patienten mit Nierensteinerkrankungen sein könnte.
Introduction
Harnkristalle bilden sich, wenn urin mit Mineralien übersättigt wird. Dies kann bei gesunden Personen auftreten, ist aber häufiger bei Personen mit Nierensteinen1. Das Vorhandensein und die Ansammlung von Harnkristallen kann das Risiko erhöhen, einen Nierenstein zu entwickeln. Insbesondere tritt dies auf, wenn Kristalle an Randalls Plaque binden, nukleieren, sich ansammeln und im Laufe der Zeitwachsen 2,3,4. Kristallurie geht der Nierensteinbildung voraus und die Beurteilung der Kristallurie kann einen prädiktiven Wert in Nierensteinmalern haben3,5. Insbesondere wurde die Kristallurie als nützlich angesehen, um das Risiko eines erneuten Auftretens von Steinen bei Patienten mit einer Geschichte von Calciumoxalat, dieSteine 6,7enthält, vorherzusagen.
Es wurde berichtet, dass Kristalle die Nierenepithel- und zirkulierende Immunzellfunktion negativ beeinflussen8,9,10,11,12,13. Es wurde bereits berichtet, dass zirkulierende Monozyten aus Calciumoxalat (CaOx) Nierensteinmalern die zelluläre Bioenergetik im Vergleich zu gesunden Personen unterdrückt haben14. Darüber hinaus reduzieren CaOx-Kristalle die zelluläre Bioenergetik und stören die Redox-Homöostase in Monozyten8. Der Verzehr von oxalatreichen Mahlzeiten kann kristalline Kristallurie verursachen, die zu Nierentubulischäden führen und die Produktion und Funktion von Makromolekülen im Urin verändern kann, die vor Nierensteinbildung schützen15,16. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Harnkristalle in Form und Größe variieren können, abhängig vom pH-Wert und der Temperatur des Urins17,18,19. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Harnproteine das Kristallverhalten modulieren20. Daudon et al.19schlugen vor, dass die Kristallurie-Analyse bei der Behandlung von Patienten mit Nierensteinerkrankungen und bei der Beurteilung ihres Ansprechens auf Therapien hilfreich sein könnte. Einige konventionelle Methoden, die derzeit zur Verfügung stehen, um das Vorhandensein von Kristallen zubewerten,umfassen Polarmikroskopie21,22, Elektronenmikroskopie23, Partikelzähler3, Urinfiltration24, Verdampfung3,5 oder Zentrifugation21. Diese Studien haben wertvolle Einblicke in das Nierensteinfeld in Bezug auf Kristallurie geliefert. Eine Einschränkung dieser Methoden war jedoch die Unfähigkeit, Kristalle mit einer Größe von weniger als 1 μm zu visualisieren und zu quantifizieren. Kristalle dieser Größe können das Wachstum von CaOx-Steinen beeinflussen, indem sie an Randalls Plaque befestigt werden.
Es wurde gezeigt, dass Nanokristalle im Vergleich zu größeren Mikrokristallen eine umfangreiche Verletzung der Nierenzellen verursachen25. Das Vorhandensein von Nanokristallen wurde im Urin unter Verwendung eines Nanopartikelanalysators26,27berichtet. Jüngste Studien haben fluoreszierend markierte Bisphosphatsonden (Alendronat-Fluorescein/Alendronat-Cy5) verwendet, um Nanokristalle mit nanoskaliger Durchflusszytometrie zu untersuchen28. Die Einschränkung dieses Farbstoffs besteht darin, dass er nicht spezifisch ist und an fast alle Arten von Steinen außer Cystein bindet. Daher kann die genaue Beurteilung des Vorhandenseins von Nanokristallen bei Einzelpersonen ein wirksames Werkzeug zur Diagnose von Kristallurie und / oder zur Vorhersage des Steinrisikos sein. Ziel dieser Studie war es, kalziumhaltige Nanokristalle (größe <1 μm) mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) nachzuweisen und zu quantifizieren. Um dies zu erreichen, wurde die NTA-Technologie in Kombination mit einem calciumbindenden Fluorophor, Fluo-4 AM, verwendet, um kalziumhaltige Nanokristalle im Urin gesunder Erwachsener nachzuweisen und zu quantifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
NTA wurde in der vorliegenden Studie verwendet, um Nanokristalle im menschlichen Urin mit einer Kalziumbindungssonde, Fluo-4 AM, zu bewerten. Es gibt keine Standardmethode, um Nanokristalle im Urin nachzuweisen. Einige Forschungsgruppen haben Nanokristalle im Urin nachgewiesen und sich auf die Verwendung umfangreicher Protokolle oder Methoden verlassen, die in ihrer Fähigkeit, die Proben zu quantifizieren, begrenzt sind27,28. Diese Studie zeigt eine spezifische …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken allen Studienteilnehmern und dem UAB CCTS Bionutrition Core und dem UAB High Resolution Imaging Service Center für ihre Beiträge. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse DK106284 und DK123542 (TM) sowie UL1TR003096 (National Center for Advancing Translational Sciences) unterstützt.
Materials
| Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
| Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
| Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
| Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
| Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
| *Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. | |||
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