호스트-병원균 상호 작용을 연구하기 위하여 동일 종에서 항체를 사용하여 면역 형광을 이중 표지합니다
Summary
여기서, 프로토콜은 숙주 병원체 상호 작용을 연구하기 위하여 동일 종에서 제기된 1 차적인 항체를 사용하여 이중 표지면역형광을 수행하는 방법을 설명합니다. 또한, 본 프로토콜에서 상이한 숙주에서 제3 항체를 포함할 수 있다. 이 접근은 어떤 세포 모형 및 병원체든에서 할 수 있습니다.
Abstract
요즘, 기생충 호스트 세포 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수있는 분자 도구의 넓은 범위를 찾을 수 있습니다. 그러나, 기생충에 있는 특정 세포 구조 및 단백질을 인식하는 상업적인 단클론 또는 다각성 항체를 얻기 위하여 몇몇 한계가 존재합니다. 게다가, trypanosomatids를 표시하기 위하여 유효한 몇몇 상업적인 항체가 있습니다. 일반적으로 기생충에 대한 다발성 항체는 사내에서 제조되며 동일한 종에서 생산되는 다른 항체와 함께 사용하기가 더 어려울 수 있습니다. 여기서, 이 프로토콜은 숙주 세포 및 병원체 상호 작용을 연구하기 위해 이중 표기 면역 형광을 수행하기 위해 동일한 종에서 자란 폴리클론 및 단일 클론 항체를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이중 라벨링 면역형광을 달성하기 위해, 마우스 폴리클론 항체를 먼저 배양한 다음 임의의 플루오로크롬에 컨쥬게이트된 이차 마우스 IgG 항체로 인큐베이션을 따르는 것이 중요하다. 그 후, 1차 항체의 흔적이 다음 이차 항체에 의해 인식되는 것을 막기 위해 추가 차단 단계가 필요하다. 이어서, 마우스 단일클론 항체 및 상이한 플루오로크롬에 공주되는 특정 IgG 서브클래스 이차 항체가 적절한 시기에 시료에 첨가된다. 또한, 상이한 종에서 자란 제3 항체를 사용하여 면역형광을 삼중 라벨링수행이 가능하다. 또한, 핵 및 액틴과 같은 구조는 특정 화합물 또는 라벨로 이후에 염색될 수 있다. 따라서, 여기에 제시된 이 접근은 1차 항체의 근원이 제한되는 어떤 세포든지에 대해 조정될 수 있다.
Introduction
세포 수준에서 숙주 세포와 병원체의 상호 작용을 연구하기 위해 바이러스, 박테리아 및 원생동물과 같은 다른 그룹이 대부분의 숙주 세포 유형을 감염시킬 수 있기 때문에 질병의 근본 원인에 대한 필수 정보를 제공한다1,2,3,4. 그것은 또한 개발 하 고 병원 체의 성장을 느리게 하거나 억제할 수 있는 잠재적인 치료 목표를 식별 하는 데 도움이 수 있습니다. 살아있는 조건에서, 생성된 항체는 자기 성분, 바이러스, 세균성 성분 또는 제품, 곰팡이, 기생충 및 그 외5에서 항원을 인식하는 책임이 있습니다5.
이러한 목적을 위해, 항체는 주로 세포 구조 및 단백질의 위치와 기능을 이해하기 위한 도구로 널리 사용된다. 다중 항체 라벨링을 이용한 여러 연구는 추가 차단 단계가 면역 지역화의 특이성에 기여한다는 것을 보여준다. 또한, 대부분의 기량 프로토콜은 동일한 숙주 종에서 항체를 포함하는 특정 상업적 단일 클론 항체를 사용하며 6,7,8,9,10,11,12,13,14를 사용한다.
일반적으로, 이중 표지 면역 형광은 관심의 세포 구조 또는 병원균 및 숙주 세포 사이의 상호 작용을 보기 위해 다른 종에서 제기 된 두 개의 항체를 사용합니다. 그러나, 이는 일부 병원체에 특이적인 상업적 단일클론 또는 폴리클론 항체가 이중 라벨링을 수행할 수 없을 때 문제가 될 수 있다. 또한, 시판되는 항체 컨쥬게이션 키트가 있으며, 1차 항체를 수치니미딜 에스테르 반응15에 의해 플루오로포레에 직접 접목할 수 있다. 문제는 이러한 키트는 종종 비싸며 라벨을 붙일 충분한 항체가 필요하다는 것입니다. 이를 알고, 우리는 성공적으로 Trypanosoma brucei16에서 단백질 국소화를 연구하기 위하여 동일 종에서 제기된 2개의 다른 항체를 사용하여 이중 면역 형광 방법을 개발했습니다. 그러나, 세포 내 기생충에 대 한, Trypanosoma cruzi를 포함 하 여, 이 접근 은 입증 되지 않았습니다. 여기서, 우리는 교차 반응 없이 동일한 종에서 제기된 1차 항체를 사용하여 세포내 T. cruzi 기생충 및 숙주 세포를 연구하기 위하여 이중 표지 면역 형광을 수행하는 방법을 보여줍니다. 이 방법 외에도, 다른 종으로부터 제3 항체를 첨가하여 삼중 면역 형광 라벨링이 확립되었다. 이러한 접근법은 항체의 근원이 제한되고 모든 세포 모형에서 사용될 수 있을 때 도움이 됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서, 우리는 동일한 숙주 종으로부터 2개의 상이한 항체를 사용하여 Trypanosoma cruzi 감염한 세포에 있는 이중 면역 라벨링을 능력을 발휘하는 프로토콜을 제시합니다. 연구하기 위하여는, 더 자세히, 감염의 연루, 핵 또는 세포소기관과 같은 호스트 세포에 있는 구조물이 프로토콜을 사용하여 표지될 수 있습니다. 또한, 배후 임베딩 씬 섹션 면역골드 라벨링 방법에 사용될 수 있다. 이 접?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Fundação 드 Amparo à Pesquisa do Estado de 상파울루 (FAPESP 2010/19547-1)에 의해 지원되었다; 2018/03677-5) MMAB, Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência-FAEPA에서 MMAB및 Coordenaçãamento de Aperfeiçoamento 데 페소알 드 니벨 슈페리어- 브라질 (CAPES) – 금융 코드 001. CG-C는 CAPES로부터 석사 및 박사 펠로우십을 받았고, LAMT-S는 CNPq로부터 박사 학위를 받았습니다. 우리는 공초점 현미경 검사법을 위한 엘리자베트 R. 밀라노와 LLC-MK2 세포를 제공한 다리오 잠보니 박사(리베이라오 프레토 의과 대학, USP)에 감사드립니다.
Materials
| Alexa Fluor 488 – IgG2b antibody | Life technologies, USA | A21141 | Goat anti-mouse |
| AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch, USA | 315-005-003 | Anti-mouse antibody |
| Alexa Fluor 488 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A11017 | Goat anti mouse |
| Alexa Fluor 594 IgG1 antibody | Life technologies, USA | A21125 | Goat anti-mouse |
| Alexa Fluor 647 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A21237 | Goat anti-mouse |
| Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b | Sigma-Aldrich, USA | R4528 | Mouse antibody |
| anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody | Our lab | In-house | Mouse antibody |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | Albumin protein |
| Detergent Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich, USA | I3021 | Nonionic Detergent |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 12657-029 | Serum |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 15140-122 | Antibiotic |
| Phalloidin Alexa Fluor 594 | Life technologies, USA | A12381 | Actin marker |
| ProLong Gold antifade with DAPI | Life technologies, USA | P36935 | Mounting media reagent |
| RPMI 1640 1X with L-glutamine | Corning, USA | 10-040-CV | Cell culture media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich, USA | T4049-100ML | Bioreagent |
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