Isolamento e coltura di macrofagi cardiaci residenti dal nodo senoatriale e atrioventricolare murino
Summary
Il protocollo qui presentato fornisce un approccio passo-passo per l’isolamento dei macrofagi residenti cardiaci dalla regione del nodo senoatriale (SAN) e del nodo atrioventricolare (AVN) dei cuori di topo.
Abstract
È stato dimostrato che i macrofagi cardiaci residenti facilitano la conduzione elettrica nel cuore. Il ritmo cardiaco fisiologico è iniziato da impulsi elettrici generati nel nodo senoatriale (SAN) e quindi condotto ai ventricoli tramite nodo atrioventricolare (AVN). Per studiare ulteriormente il ruolo dei macrofagi residenti nel sistema di conduzione cardiaca, è necessario un adeguato isolamento dei macrofagi residenti da SAN e AVN, ma rimane impegnativo. Qui, forniamo un protocollo per la microdissezione affidabile di SAN e AVN nei cuori murini seguita dall’isolamento e dalla coltura dei macrofagi residenti.
Entrambi, SAN che si trova alla giunzione della crista terminalis con la vena cava superiore, e AVN che si trova all’apice del triangolo di Koch, sono identificati e microsezionati. La corretta localizzazione è confermata dall’analisi istologica del tessuto eseguita con la colorazione tricromica di Masson e dall’anti-HCN4.
I tessuti microdissezionati vengono quindi digeriti enzimaticamente per ottenere sospensioni monocellulari seguite dall’incubazione con uno specifico pannello di anticorpi diretti contro marcatori di superficie specifici del tipo cellulare. Ciò consente di identificare, contare o isolare diverse popolazioni cellulari mediante selezione cellulare attivata fluorescente. Per differenziare i macrofagi residenti cardiaci da altre cellule immunitarie nel miocardio, in particolare i macrofagi derivati dai monociti reclutati, è necessaria una delicata strategia di gating ideata. In primo luogo, le cellule della linea linfoide vengono rilevate ed escluse da ulteriori analisi. Quindi, le cellule mieloidi sono identificate con macrofagi residenti determinati dall’alta espressione di CD45 e CD11b e dalla bassa espressione di Ly6C. Con la selezione cellulare, i macrofagi cardiaci isolati possono quindi essere coltivati in vitro per diversi giorni per ulteriori indagini. Descriviamo quindi un protocollo per isolare i macrofagi residenti cardiaci situati all’interno del sistema di conduzione cardiaca. Discutiamo le insidie nella microdissezione e nella digestione di SAN e AVN e forniamo una strategia di gating per identificare, contare e ordinare in modo affidabile i macrofagi cardiaci mediante la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.
Introduction
Il nodo senoatriale (SAN) avvia fisiologicamente l’impulso elettrico ed è, quindi, il pacemaker primario del cuore. Il nodo atrioventricolare (AVN) conduce l’impulso elettrico dagli atri ai ventricoli e funge anche da pacemaker sussidiario1. In generale, la generazione e la conduzione di impulsi elettrici è un processo complesso che può essere modulato da vari fattori2, inclusi i macrofagi residenti nelle regioni SAN / AVN. Un recente studio di Hulsmans et al. dimostra una popolazione specifica di macrofagi residenti cardiaci che sono arricchiti nell’AVN e funzionano come attori chiave nel mantenere un battito cardiaco costante3. Hanno scoperto che i macrofagi sono accoppiati elettricamente ai cardiomiociti e potrebbero cambiare le proprietà elettriche dei cardiomiociti accoppiati. Gli autori osservano inoltre che tali cellule conduttrici che si intercedono con i macrofagi sono presenti anche in altri componenti del sistema di conduzione cardiaca, come il SAN.
Attualmente, non è completamente noto se il fenotipo dei macrofagi cardiaci residenti differisca tra le regioni cardiache. Tuttavia, è stato dimostrato che il microambiente tissutale può influenzare la trascrizione e il rinnovamento proliferativo dei macrofagi tissutali4. Inoltre, poiché è stato dimostrato che il fenotipo dei cardiomiociti è diverso tra le regioni, gli effetti funzionali dei macrofagi sui cardiomiociti possono anche essere specifici per regione, anche se il fenotipo macrofagico stesso può essere lo stesso. Pertanto, sono necessari ulteriori studi su specifiche regioni cardiache.
Studi recenti hanno dimostrato che, allo stato stazionario, i macrofagi residenti nei tessuti si stabiliscono prenatale, insorgono indipendentemente dall’ematopoiesi definitiva e persistono nell’età adulta5. Tuttavia, dopo deplezione dei macrofagi o durante l’infiammazione cardiaca, glihimonociti Ly6c contribuiscono a ricostituire la popolazione di macrofagi cardiaci6. Gli studi che coinvolgono il tracciamento del lignaggio genetico, la parabiosi, la mappatura del destino e il tracciamento cellulare hanno mostrato la coesistenza di una varietà di popolazioni di macrofagi residenti nei tessuti in organi e tessuti e, inoltre, un diverso comportamento cellulare dei sottogruppi di macrofagi che sono potenzialmente associati alla loro ontogenesi 7,8,9.
La caratterizzazione dei macrofagi cardiaci residenti ha beneficiato dell’uso della selezione delle cellule attivate magnetiche (MACS) e della selezione delle cellule attivate fluorescenti. Questi metodi sono particolarmente utili per isolare specifiche popolazioni cellulari da più frazioni di tessuto etichettandole con i loro marcatori di superficie cellulare. Ciò non solo porta ad una maggiore purezza del tipo di cellula immunitaria isolata, ma consente anche l’analisi fenotipica. Qui, presentiamo un protocollo che include cellule rivestite di perline magnetiche seguite da selezione cellulare attivata fluorescente per l’arricchimento di macrofagi residenti cardiaci specificamente isolati dalla regione SAN e AVN.
Per esplorare le caratteristiche dei macrofagi residenti cardiaci nel sistema di conduzione e la loro funzione per la conduzione cardiaca e l’aritmogenesi, la localizzazione e la dissezione precise di SAN e AVN sono fondamentali. Per la microdissezione di SAN e AVN, vengono utilizzati punti di riferimento anatomici per l’identificazione della regione10. In breve, SAN si trova all’incrocio della vena cava superiore e dell’atrio destro. AVN si trova all’interno del triangolo di Koch, che è delimitato anteriormente dal foglietto settale della valvola tricuspide e posteriormente dal tendine di Todaro11. Forniamo anche un’accurata procedura di microdissezione di SAN e AVN nei topi che è confermata dall’istologia e dalla colorazione con immunofluorescenza.
I macrofagi residenti isolati potrebbero essere utilizzati per ulteriori esperimenti come il sequenziamento dell’RNA o potrebbero essere recuperati e coltivati per più di due settimane consentendo vari esperimenti in vitro. Pertanto, il nostro protocollo descrive una procedura di grande valore per l’immuno-ritmologo. La Tabella 1 mostra la composizione di tutte le soluzioni necessarie, la Figura 1 mostra i punti di riferimento della microdissezione per SAN e AVN. La Figura 2 illustra schematicamente la localizzazione di SAN e AVN. La Figura 3 mostra la colorazione istologica di SAN e AVN (colorazione tricromatica e immunofluorescenza di Masson). La Figura 4 mostra una strategia di gating passo-passo per isolare i macrofagi residenti cardiaci mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo manoscritto, descriviamo un protocollo per l’arricchimento di macrofagi residenti cardiaci specificamente dalle regioni SAN e AVN ad alta purezza.
I macrofagi sono divisi in sottopopolazioni in base alla loro posizione anatomica e al fenotipo funzionale. Possono anche passare da un fenotipo funzionale all’altro in risposta a segnali microambientali variabili13. Rispetto ad altri organi come il midollo osseo e il fegato, il tessuto cardiaco contiene una percent…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal China Scholarship Council (CSC, a R. Xia), dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss, 81Z0600206 a S. Kääb, 81Z0600204 a C.S.), la Fondazione Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), l’SFB 914 (progetto Z01 a S. Massberg), l’ERA-NET sulle malattie cardiovascolari (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss) e la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella preparazione dei manoscritti.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories | ||
Referencias
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