Quantificação em tempo real de espécies de oxigênio reativo em neutrófilos infectados com meningite escherichia coli
Summary
Escherichia coli é a principal causa de meningite bacteriana gram-negativa neonatal. Durante a infecção bacteriana, espécies reativas de oxigênio produzidas por neutrófilos desempenham um papel bactericida importante. Aqui introduzimos um método para detectar as espécies reativas de oxigênio em neutrófilos em resposta à meningite E. coli.
Abstract
Escherichia coli (E. coli) é a bactéria gram-negativa mais comum que causa meningite neonatal. A ocorrência de bacteremia e penetração bacteriana através da barreira hemencefálica são passos indispensáveis para o desenvolvimento da meningite E. coli. As espécies reativas de oxigênio (ROS) representam os principais mecanismos bactericidas dos neutrófilos para destruir os patógenos invadidos. Neste protocolo, a produção de ROS intracelular dependente do tempo em neutrófilos infectados com meningite E. coli foi quantificada por sondas ROS fluorescentes detectadas por um leitor de microplaca de fluorescência em tempo real. Este método também pode ser aplicado à avaliação da produção de ROS em células de mamíferos durante interações patógenos-hospedeiros.
Introduction
Meningite bacteriana neonatal é uma doença infecciosa pediátrica comum. Escherichia coli (E. coli) com uma cápsula K1 é o patógeno Gram-negativo mais comum que causa meningite bacteriana neonatal, representando cerca de 80% da incidência total1,2,3. Apesar dos avanços na quimioterapia antimicrobiana e no cuidado de apoio, a meningite bacteriana ainda é uma das condições mais devastadoras com alta morbidade e mortalidade4.
A ocorrência de meningite bacteriana neonatal geralmente começa com a bacteremia causada pela entrada de bactérias patogênicas na circulação periférica das lesões locais dos recém-nascidos, seguida pela penetração através da barreira hemoencefálica (BBB) no cérebro, resultando na inflamação das meninges4. O surgimento da bacteremia depende da interação entre bactérias e células imunes hospedeiras, incluindo neutrófilos e macrófagos, etc. Os neutrófilos, que respondem por ~50-70% dos glóbulos brancos, são a primeira linha de defesa contra infecções bacterianas5,6. Durante a invasão de bactérias, os neutrófilos ativados são recrutados para os locais infecciosos e liberam espécies reativas de oxigênio (ROS), incluindo o ânion de superóxido, peróxido de hidrogênio, radicais hidróxil e oxigênio singlet7. O ROS sofre reações redox com a membrana celular, moléculas de ácido nucleico e proteínas da bactéria, resultando na lesão e morte da bactéria invasora8. A mitocôndria é o principal local da produção de ROS em células eucarióticas, e várias oxidases (por exemplo, nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) complexo oxidase, sistema lipoxygenase, proteína quinase C e sistema ciclooxygenase) mediam a produção de ROS9,10. A medição em tempo real da produção de ROS, representando o principal mecanismo antimicrobiano em neutrófilos, é um método útil para estudar a defesa hospedeira durante a interação bactérias-hospedeiras.
Neste protocolo, a produção de ROS dependente do tempo em neutrófilos infectados com meningite E. coli foi quantificada com uma sonda ROS fluorescente DHE, detectada por um leitor de microplaca de fluorescência em tempo real. Este método também pode ser aplicado à avaliação da produção de ROS em outras células mamíferas durante a interação patógeno-hospedeiro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os neutrófilos agem como o componente mais abundante dos glóbulos brancos na circulação sanguínea humana. São importantes células efeitos no sistema imunológico humano inato, que constrói a primeira linha de defesa contra a invasão de patógenos11. A geração de ROS representa um dos principais mecanismos bactericidas de neutrófilos após a fagocitose11. Estudos recentes mostraram que uma estrutura semelhante a uma rede liberada por um neutrófilo chamado armadi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31670845, 31870832, 32000811) e pelo Programa de Distinto Professor da Província de Liaoning (LJH2018-35).
Materials
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
Referencias
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants </=60 Days Old Treated in Emergency Departments. Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
- Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
- Kim, K. S. Human Meningitis-Associated Escherichia coli. EcoSal Plus. 7 (1), (2016).
- Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
- Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
- Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
- Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
- Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
- Haynes, A. P., Fletcher, J. neutrophil function test. Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).
- Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
- Siano, B., Oh, H., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).
