Summary
Ligand Assay'ın Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi (DRaCALA), orfeome kütüphanesi kullanarak bir organizmanın küçük ligand bağlayıcı proteinlerini tanımlamak için kullanılabilir.
Abstract
Son on yılda bakteriyel fizyolojide küçük sinyal moleküllerinin anlaşılmasında muazzam bir ilerleme kaydedildi. Özellikle, nükleotid türevi ikincil habercilerin (NSM) hedef proteinleri sistematik olarak tanımlanmış ve model organizmalarda incelenmiştir. Bu başarılar esas olarak, bu küçük moleküllerin hedef proteinlerini sistematik olarak tanımlamak için kullanılan ligand tahlilinin (DRaCALA) yakalama bileşik tekniği ve diferansiyel radyal kılcal etkisi de dahil olmak üzere birkaç yeni tekniğin geliştirilmesinden kaynaklanmaktadır. Bu makalede, DRaCALA tekniğinin bir örneği ve video gösterimi olarak NSM'lerin, guanosine penta ve tetrafosfatların (p)ppGpp kullanımı açıklanmaktadır. DRaCALA kullanılarak, bu tahlilin gücünü gösteren Escherichia coli K-12 model organizmasında bilinen 20'den 9'u ve (p)ppGpp'nin 12 yeni hedef proteini tanımlanmıştır. Prensip olarak, DRaCALA radyoaktif izotoplar veya floresan boyalar ile etiketlenebilen küçük ligandların incelenmesi için kullanılabilir. Bu tekniğin daha fazla uygulanması için DRaCALA'nın kritik adımları, artıları ve eksileri burada tartışılmaktadır.
Introduction
Bakteriler sürekli değişen ortamlara uyum sağlamak için birkaç küçük sinyal molekülü kullanır1,2. Örneğin, otoindüserler, N-acylhomoserine lactones ve modifiye oligopeptidleri, popülasyon davranışını koordine etmek için bakteriler arasındaki hücreler arası iletişime aracılık eder, çekirdek algılama olarak bilinen bir fenomen2. Bir diğer küçük sinyal molekülü grubu, yaygın olarak çalışılan döngüsel adenozin monofosfat (cAMP), döngüsel di-AMP, döngüsel di-guanosine monofosfat (döngüsel di-GMP) ve guanosine penta ve tetra fosfatları (p)ppGpp1dahil olmak üzere NSM'lerdir. Bakteriler bu NSM'leri çeşitli stres koşullarına yanıt olarak üretirler. Üretildikten sonra, bu moleküller hedef proteinlerine bağlanır ve karşılaşılan streslerle başa çıkmak ve bakteriyel sağkalımını artırmak için birkaç farklı fizyolojik ve metabolik yolu düzenler. Bu nedenle, hedef proteinlerin tanımlanması, bu küçük moleküllerin moleküler fonksiyonlarını çözmek için kaçınılmaz bir ön koşuldur.
Son on yıl, esas olarak bu küçük moleküllerin hedef proteinlerini ortaya çıkaran çeşitli teknik yenilikler nedeniyle, bu küçük sinyal molekülleri hakkında bir bilgi patlamasına tanık oldu. Bunlar arasında yakalama bileşik tekniği3,4,5ve ligand tahlil (DRaCALA)6'nın diferansiyel radyal kılcal etkisi bu makalede tartışılacaktır.
Vincent Lee ve iş arkadaşları tarafından 20116'daicat edilen DRaCALA, nitroselüloz membran yeteneğini farklı olarak sequester serbest ve proteine bağlı ligandlara dağıtır. Proteinler gibi moleküller nitroselüloz bir zar üzerinde yayılamazken, NSM'ler gibi küçük ligandlar yayılabilir. NSM'yi(örneğin,ppGpp) test edilecek proteinle karıştırarak ve membran üzerinde tespit ederek, iki senaryo beklenebilir (Şekil 1): Eğer (p)ppGpp proteine bağlanırsa, radyolabeled (p)ppGpp protein tarafından noktanın merkezinde tutulur ve dışarı doğru dağılmasın, yoğun bir küçük nokta (yani. güçlü radyoaktif sinyal) bir fosforimager altında. Bununla birlikte, (p)ppGpp proteine bağlanmazsa, tekdüze arka plan radyoaktif sinyali olan büyük bir nokta üretmek için serbestçe dışa doğru dağılacaktır.
Ayrıca, DRaCALA, protein yeterli miktarda mevcutsa, tüm hücre lisatında küçük bir molekül ile amaçlanmamış bir protein arasındaki etkileşimi tespit edebilir. Bu basitlik, bir ORFeome ifade kitaplığı kullanarak protein hedeflerini hızla tanımlamada DRaCALA'nın kullanılmasına izin verir. Nitekim, cAMP7, siklik di-AMP8, döngüsel di-GMP9,10ve (p)ppGpp 11,12,13hedef proteinleri DRaCALA kullanılarak sistematik olarak tanımlanmıştır. Bu video makalesi, başarılı bir DRaCALA taraması gerçekleştirmedeki kritik adımları ve dikkat edilmesi gerekenleri göstermek ve açıklamak için örnek olarak (p)ppGpp kullanır. Not olarak, DRaCALA14'ün daha kapsamlı bir açıklamasının, DRaCALA'yı gerçekleştirmeden önce bu makaleyle birlikte okunması şiddetle tavsiye edilir.
Şekil 1: DRaCALA prensibi. (A) DRaCALA tahlilinin şeması. Ayrıntılar için metne bakın. (B) Bağlama fraksiyonunun nicelleştirilmesi ve hesaplanması. Ayrıntılar için metne bakın. Kısaca, DRaCALA lekeleri, tüm noktayı ve iç koyu noktayı(yani,test edilen proteinin bağlanması nedeniyle tutulan (p)ppGpp) çevreleyen iki daire çizilerek analiz edilecektir. Spesifik bağlama sinyali, spesifik olmayan arka plan sinyalini çıkardıktan sonra iç dairenin (S1) radyoaktif sinyalidir (A1 × ((S2-S1)/(A 2 -A1))) tarafından hesaplanır). Bağlama fraksiyonu, toplam radyoaktif sinyale (S2) bölünen belirli bağlama sinyalidir. Kısaltmalar: DRaCALA = Ligand Tahlilinin Diferansiyel Radyal Kılcal Hareketi; (p)ppGpp = guanosine penta ve tetrafosfatlar; RT = oda sıcaklığı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tüm hücre lysates hazırlanması
- E. coli K-12 ASKA ORFeome toplama suşlarını 96 kuyu derinliğindeki kuyu plakalarında 25 μg/mL kloramfenikol içeren15 ile 1,5 mL Lysogeny et suyu (LB) içine aşılayın. 30 °C'de 18 saat boyunca gece boyunca (O/N) büyüyün ve 160 rpm'de sallanın. Ertesi gün, 6 saat boyunca 30 °C'de protein ekspresyona neden olmak için O/N kültürlerine izopropil β-d-1-tiyogalactopyranoside (IPTG) (son 0,5 mM) ekleyin.
- Pelet hücreleri 10 dakika boyunca 500 x g'da. Peletleri kullanıma kadar -80 °C'de dondurun. Hücreleri lyse etmek için 150 μL lizis tamponU L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2,peletin yeniden diriltmek için 2 mM fenillemetilsülfonil florür (PMSF), 40 μg / mL DNaz 1 ve 0.5 mg / mL lizozim) ile desteklenmiştir.
- Hücreleri -80 °C'de 30 dakika dondurun ve ardından 37 °C'de 20 dakika çözün. Hücreleri renksiz etmek için bu döngüyü üç kez tekrarlayın. Kullanımdan önce lysates'i -80 °C'de saklayın.
2. Relseq ve GppA'nın Saflaştırılması
NOT: Streptococcus equisimilis'ten Relseq ve E. coli K-12'den GppA proteinleri sırasıyla radyolabeled pppGpp ve ppGpp'yi sentezlemek için kullanılır.
- Her proteini aşırı ifade eden hücreleri büyütün ve toplayın.
- E. coli BL21 DE3 zorluğunu LB suyunda üstel faza (optik yoğunluk (OD) ~0,3-0,4) kadar büyütün ve 5 dakika boyunca 6000 x g'da 1 mL kültür aşağı çevirin. Süpernatantı deklare edin ve hücreleri 100 μL buz gibi TSB suyu ile yeniden depola (LB suyu 0.1 g/mL PEG3350, 0.05 mL/ mL dimetilsüllfoksit, 20 mM MgCl2ile desteklenmiştir).
- Histidin etiketli relseq ve gppAtaşıyan plazmidleri, her 100 ng'yi TSB'deki yukarıdaki hücre süspansiyonlarıyla karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. Hücreleri 40 s için 42 °C'de ısı şoku. Karışımı 2 dakika boyunca buza yerleştirin ve hücrelerin 160 rpm'de ajitasyonla 37 °C'de 1 saat boyunca iyileşmesini sağlamak için oda sıcaklığında 1 mL LB suyu ekleyin.
- Kurtarılan hücreleri LB agar plakalarında ilgili antibiyotiklerle birlikte plakalayın (Relseq:100μg/mL ampisilin; GppA: 30 μg/mL kanamycin). Ertesi gün, LB suyundaki kolonileri aşılayıp her iki türün de 37 °C'de O/N ön kültürlerine başlayın.
- 18 saat sonra, 500 mL LB ortamını 10 mL O/N kültürleri ve ilgili antibiyotiklerle aşıla. 37 °C'de 160 rpm'de titreyerek kültürleri büyütün. OD600nm 0.5-0.7'ye ulaştığında, 0.5 mM IPTG ekleyerek ve 30 °C'de 3 saat boyunca 160 rpm'de sallanarak protein ekspresyona neden olan protein ekspresyona neden olan.
- 4 °C'de 10 dakika boyunca 6084 x g'da dönerek hücreleri toplayın. Peleti 20 mL buz gibi 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ve 1912 x g'da 4 °C'de 20 dakika boyunca yeniden santrifüjle yeniden depola. Süpernatantı dekant ve kullanmadan önce peletleri -20 °C'de dondurun.
- Nikel-nitrilotriyastik asit (Ni-NTA) benzeşim saflaştırması
NOT: Bu noktadan sonra numunelerin soğuk olduğundan emin olun.- 40 mL buz gibi lizis tamponU L2 ekleyin (50 mM Tris pH 7.5, Peletin yeniden canlandırmak için proteaz inhibitörleri (EDTA içermeyen tablet; Malzeme Masasınabakın) ile desteklenmiş 150 mM NaCl, %5 gliserol, 10 mM imidazol, 10 mM β-mercaptoethanol. Hücreleri sonikasyon yoluyla lyse (60% genlik, 2 s ON / 4 s OFF 8 dk ON). 4 °C'de 40 dakika boyunca 23.426 x g'da dönerek lisatı temizleyin ve saflaştırma için süpernatant ile devam edin.
- Yukarıdaki santrifüjleme sırasında Ni-NTA reçinesini hazırlayın.
- 500 μL homojenize Ni-NTA reçinesini ayakta duran bir polipropilen kromatografi sütununa aktarın ve 15 dakika yetinip depolama çözeltisinin akmasına izin verin. Reçineyi iki kez 15 mL ultra saf suyla yıkayın ve ardından sütunu 15 mL lizis tamponU L2 ile yıkayın.
- Temizlenmiş hücre likırını 1. Kolonu 30 mL yıkama tamponu ile yıkayın (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, % 5 gliserol, 20 mM imidazol).
- Proteinleri 400 μL elution tamponu (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, % 5 gliserol, 500 mM imidazol) ile üç kez elute edin. Ardından, başka bir 300 μL elution tamponu ile tekrarlayın. Eluted proteinleri 700 μL'lik son bir hacimde birleştirin.
- Jel filtrasyonu
- Jel filtrasyon tamponu hazırlayın (50 mM Tris, pH 7.5; 200 mM NaCl; % 5 gliserol). Boyut dışlama sütununu jel filtrasyon arabelleği bir sütun hacmi (25 mL) ile yıkayın.
- Yukarıdaki 700 μL örneğini 500 μL döngü kullanarak yükleyin, 0,5 mL / dak'ta çalıştırın ve ilgili proteinleri içeren her biri 0,5 mL hacimde 2-3 fraksiyon toplayın.
- Bir spin sütunu kullanarak proteinlerin her birini içeren fraksiyonları birleştirin ve konsantre edin ve Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.
3. 32P etiketli pppGpp ve ppGpp sentezi
- Küçük ölçekli bir Relseq reaksiyonını bir vida kapağı tüpüne monte edin (bkz. Tablo 1).
NOT: Radyoaktif reaktiflerle yalnızca lisanslı bir yerde ve kişisel koruyucu ekipmanlarla çalışın.
| Hacim (μL) | ||
| Küçük ölçekli | Büyük ölçekli | |
| Ultra saf su | ||
| 10x Relseq arabelleği* | 2 | 50 |
| ATP (8 mM finali) | ||
| Relseq (4 μM finali) | ||
| 32 P-α-Guanosine trifosfat (GTP) (son 120 nM) (DİkKAT) | 0.2 | 5 |
| toplam | 20 | 500 |
Tablo 1: 32P etiketli pppGpp'nin küçük ve büyük ölçekli sentez reaksiyonları için bilgilerin bir araya getirilir. *10x Relseq tamponu 250 mM Tris-HCl, pH 8.6 içerir; 1M NaCl; 80 mM MgCl2. Kısaltma: pppGpp = guanosin pentafosfat.
- Tüpü 37 °C'de bir termomikserde 1 saat, daha sonra 95 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın ve 5 dakika boyunca buza yerleştirin. Çökeltilmiş proteini 5 dakika boyunca 15.700 x g'da aşağı çevirin ve süpernatantı (sentezlenmiş 32P-pppGpp) yeni bir vida kapağı tüpüne aktarın.
- 32P-pppGpp'den 32P-ppGpp sentezlemek için, 32p-pppGpp ürününün yarısını yeni bir vidalı kapak tüpüne aktarın ve 1 μM GppA ekleyin. Tüpü 37 °C'de 10 dakika, 95 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından 5 dakika boyunca buza yerleştirin.
- Çökeltilmiş proteini 5 dakika boyunca 15.700 x g'da aşağı çevirin ve süpernatantı (sentezlenmiş 32P-ppGpp) yeni bir vida kapağı tüpüne aktarın.
- 32P-pppGpp ve 32P-ppGpp'yi, 1,5 M KH2PO 4 , pH 3.4'ü mobil faz olarak kullanarak ince tabaka kromatografisi (TLC) plakasında (polietileninemiilen modifiye selüloz TLC plakaları) 1 μL çalıştırarak analiz edin.
NOT: Kontrol olarak α-32P etiketli guanosin 5'-trifosfat(32P-α-GTP) kullanın. - TLC plakasını tamamen kurulayın, şeffaf bir plastik klasör arasına yerleştirin ve 5 dakika boyunca bir depolama fosfor ekranına maruz bırakın. Fosforimager kullanarak sinyalleri görselleştirin ve ölçün.
NOT: 32P-pppGpp ve 32P-ppGpp oranları% 85'ten yüksek olduğunda, büyük ölçekli bir reaksiyon (500 μL, tarama için yeterli 20 96 kuyu plakası) Masa 1kullanılarak monte edilebilir ve sentezlenebilir.
4. (p)ppGpp hedef proteinlerinin DRaCALA taraması
- 20 μL tüm hücre lysates'i çözün ve 96 kuyulu V tabanlı bir mikroter plakasına aktarın. Serratia marcescens'ten2,5 U/well endonuclease ekleyin ve lysate viskozitesini azaltmak için 15 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Lysates'i 20 dakika boyunca buza yerleştirin.
- 32P-pppGpp ve 32P-ppGpp'yi 1:1 oranında karıştırın ve (p)ppGpp'nin son konsantrasyonunun 4 nM'ye eşit olmasını sağlamak için 1x lizis tampon L1 ekleyin.
NOT: pppGpp ve ppGpp arasındaki kimyasal benzerlik göz önüne alındığında, her iki kimyasalın bir karışımı tarama işlemini basitleştirecektir. - (p)ppGpp karışımının 10 μL'sini hücre lisatıyla eklemek ve karıştırmak için çok kanallı pipet ve filtrelenmiş pipet uçları kullanın. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
- 96 x pin aletini 30 s için %0,01 iyonik olmayan deterjan çözeltisine yerleştirerek yıkayın ve 30 sn boyunca bir kağıt mendil üzerinde kurulayın. Pim aletinin yıkanması 3x'i tekrarlayın.
- Pim aletini yukarıdaki 96 kuyulu numune plakalarının içine yerleştirin ve 30 sn bekleyin. Pim aletini düz bir şekilde kaldırın ve 30 sn boyunca bir nitroselüloz zarı üzerine yerleştirin.
NOT: Bir nokta eksikse, ilgili numunelerin 2 μL'sini pipet ve filtrelenmiş uçlarla tespit edin. Aşağıda belirtildiği gibi aynı numunenin bir kopyasının yapılması önerilir. - Rt'de membranı 5 dakika kurutun. Membranı şeffaf bir plastik klasör arasına yerleştirin ve 5 dakika boyunca bir depolama fosfor ekranına maruz bırakın. Fosforimager kullanarak görselleştirin.
5. Potansiyel hedef proteinlerin ölçülmesi ve tanımlanması
- Görselleştirilmiş plakaların .gel dosyasını açmak için fosforimager ile ilişkili analiz yazılımını kullanın. 12 sütun x 8 satırlık bir kılavuz ayarlayarak 96 noktayı tanımlamak için Dizi çözümleme işlevini kullanın.
- Tüm noktaların dış kenarını çevrelemek için büyük daireler tanımlayın (bkz. Şekil 1B). Tanımlanan büyük dairelerin Volumn+Arka Planını ve Alanını dışa aktarın ve bir elektronik tabloya kaydedin.
NOT: Gerekirse, her bir daireyi lekelerle mükemmel bir şekilde örtüşecek şekilde yeniden konumlandırın ve her bir daireyi gerçek noktadan biraz daha büyük hale getirmek için yeniden boyutlandırın. - Küçük iç noktaları çevrelemek için tanımlanan daireleri küçültün. Tanımlanan küçük dairelerin Volumn+Backgroundve Area alanlarını dışarı verin ve elektronik tabloya kaydedin.
- Şekil 1B'dekidenklemi kullanarak elektronik tablodaki bağlama kesirlerini hesaplayın ve verileri çizin. Diğer kuyuların çoğuna kıyasla yüksek bağlayıcı fraksiyonlar gösteren kuyulardaki potansiyel bağlayıcı proteinleri tanımlayın.
Şekil 2: DRaCALA tarama sürecinin genel iş akışı. Bir Escherichia coli ASKA koleksiyonundan protein üretimi indüklenir ve hücreler lysed edilir. Bu arada, rekombinant proteinler Relseq-His ve GppA-His saflaştırılarak 32P-α-GTP'den 32P etiketli pppGpp ve ppGpp sentezlemek için kullanılır. Radyoaktif olarak etiketlenmiş (p)ppGpp molekülleri daha sonra lysates ile karıştırılır ve 96 pin aracı, daha sonra bir fosfor depolama ekranına, görüntülemeye ve radyoaktif sinyallerin niceliğine maruz kalmak için karışımları nitroselüloz bir zara tespit etmek için kullanılır. Kısaltmalar: DRaCALA = Ligand Tahlilinin Diferansiyel Radyal Kılcal Hareketi; (p)ppGpp = guanosine penta ve tetrafosfatlar; RT = oda sıcaklığı; IPTG = izopropil β-d-1-tiyogalactopyranoside; GTP = guanosin 5'-trifosfat; SDS-PAGE = sodyum dodecylsulfate-poliakrilamid jel elektroforez; TLC = ince tabaka kromatografisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokolün ardından genellikle iki tür sonuç verecektir (Şekil 3).
Şekil 3A, kuyuların çoğundan nispeten düşük arka plan bağlama sinyallerine (bağlama fraksiyonları < 0.025) sahip bir plaka göstermektedir. Kuyu H3'ten gelen pozitif bağlama sinyali, diğer kuyular için gözlemlenenden çok daha yüksek olan ~0.35'in bağlayıcı bir kısmını verir. Niceleme olmadan bile, iyi H3 dikkat çekicidir, bu da iyi H3 ile ifade edilen bir hedef proteinin pppGpp, ppGpp veya her ikisine de bağlandığını göstermektedir. Gerçekten de, H3 kuyusunda aşırı ifade edilen protein, (p)ppGpp12 , 16'yı bağladığı bilinen hipoksantin fosforbosyltransfeaz Hpt'dir.
Şekil 3: Aska Plakası-50'nintemsili DRaCALA tarama plakaları (solda) ve nicelik (sağda). (A) DRaCALA lekeleri. Tek olumlu vuruş olan Hpt, hem nokta hem de nicelik diyagramında öne çıkan güçlü bir bağlama sinyali verdi. (B,C) Yeniden düzenlenmiş plaka 31'in iki çoğaltma DRaCALA noktası. Siyah kırık daireler ve oklar (p)ppGpp'nin gerçek hedef proteinlerini gösterirken, kırmızı kırık daireler yanlış pozitifleri gösterir. Ayrıntılar için metne bakın. Kısaltmalar: DRaCALA = Ligand Tahlilinin Diferansiyel Radyal Kılcal Hareketi; (p)ppGpp = guanosine penta ve tetrafosfatlar; RT = oda sıcaklığı; IPTG = izopropil β-d-1-tiyogalactopyranoside; GTP = guanosin 5'-trifosfat; SDS-PAGE = sodyum dodecylsulfate-poliakrilamid jel elektroforez; TLC = ince tabaka kromatografisi; Hpt = hipoksantin fosforioltransfeaz; PrfC = peptit zinciri salınım faktörü RF3; NadR = NMN adenylyltransfeaz; HflX = çevirisel GTPase. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Taramanın diğer tipik sonucu Şekil 3B,C'de gösterilmiştir. Bu plakada, birkaç kuyu Şekil 3A'dakilerdennispeten daha yüksek arka plan bağlama sinyalleri gösterdi. Bu, birçok kuyu için nispeten güçlü iç noktalardan açıkça görülebilir. Niceleme ayrıca birçok kuyunun 0.02-0.04 aralığında bağlayıcı fraksiyonlara sahip olduğunu gösterdi. Bağlama sinyalinin daha yüksek bir arka planı, hem DNase I hem de S. marcescens'tengelen endonuclease ile yapılan tedavilere rağmen tüm hücre lizatının viskoz olması nedeniyle ortaya çıktı . Bunun gibi plakalar için, plakanın iki çoğaltma noktasını karşılaştırmak önemlidir (adım 4.5; Şekil 3B,C). Her iki plakanın nicelemesi, otantik pozitif hedeflerin (siyah daireler, kuyular A10 PrfC, B11 NadR) sürekli olarak yüksek bağlayıcı fraksiyonlar verme eğiliminde olduğunu göstermektedir.
Özellikle, bazı gerçek hedefler de yanlış pozitifler (kırmızı daireler) gibi değişken bağlayıcı fraksiyonlar (Well D5, HflX12)verebilir. Bu değişkenliğin nedeni, bir kütüphanedeki tüm proteinlerin çözünür biçimde ve gerekli miktarlarda ifade olmamasında yatmaktadır. Bir proteinin konsantrasyonu Kd değerine yakın veya hemen altındaysa, gerçek hedefler için bile değişken bağlama sonuçları beklenebilir. Gerçekten de, ASKA suşu12'denbüyük miktarlarda çözünür HflX proteini elde edildi. Bu proteinlerin gerçek bağlayıcı olup olmadığını belirlemek için, potansiyel proteinler homojenliğe saflaştırılmalı ve proteinlerin daha yüksek bir konsantrasyonu (50-100 μM) kullanılarak bağlanmalıdır.
Bu tarama ile, (p)ppGpp 12'nin bilinen20 hedef proteinden 9'u tanımlanmıştır (tartışma bölümüne bakın), DRaCALA'nın bu görev için yararlılığını doğrular. Ek olarak, (p)ppGpp'nin 12 yeni hedefi keşfedildi ve onaylandı ve DRaCALA'nın (p)ppGpp'nin yeni hedef proteinlerini ortaya çıkarmak için güçlü bir teknik olduğunu gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DRaCALA taramasının yapılmasında kritik adımlardan biri iyi tüm hücre lysates elde etmektir. İlk olarak, test edilen proteinler büyük miktarlarda ve çözünür formlarda üretilmelidir. İkincisi, hücrelerin lizisi eksiksiz olmalı ve lizat viskozitesi minimum olmalıdır. Lysozyme'ın dahil edilmesi ve üç donma-çözülme döngüsünün kullanılması genellikle hücreleri tamamen iyse etmek için yeterlidir. Bununla birlikte, serbest bırakılan kromozomal DNA lizozu viskoz yapar ve yüksek arka plan bağlama sinyali oluşturur, bu da Şekil 3B,C'degösterildiği gibi yanlış pozitiflere neden olarak ortaya çıkarır. Bunu azaltmak için, S. marcescens'ten DNase 1 ve/veya endonuclease kullanılabilir ve örnekler DNA'yı bozmak için daha uzun süre inkübe edilebilir.
Büyük ölçekli bir tarama yapmadan önce tüm hücre lisat hazırlığı ve DRaCALA bağlama tahlilinin koşullarını optimize etmek için hem negatif (boş plazmid vektör) hem de pozitif (bilinen hedef protein) kontroller kullanılmalıdır. Böyle bir en uygun durum bulunduğunda, kontrolleri her plakanın gerçek taramasına dahil etmek gereksiz hale gelir. Bunun nedeni, tarama prosedürünün çok kısa olması ve bir tabaktaki proteinlerin çoğunun (p)ppGpp'ye bağlanmaması beklendiğinden. Bu nedenle, bu proteinler bağlayıcı fraksiyonları ölçerken negatif kontrol görevi gösterir (Şekil 3).
Daha saf 32P etiketli pppGpp ve ppGpp üretimi de DRaCALA taraması için gereklidir. Örneğin, GTP'den pppGpp'ye dönüştürme oranı değişebilir. Bu nedenle, pH'ı, kullanılan magnezyum ve enzim konsantrasyonlarını ve reaksiyon süresini optimize etmek önemlidir. Bu nedenle, büyük ölçekli bir reaksiyon kurmadan önce en iyi koşulu belirlemek için küçük ölçekli reaksiyonlar önemlidir.
DRaCALA'nın, yakalama bileşik tekniği gibi diğer tekniklerle karşılaştırıldığında bazı avantajları ve dezavantajları olduğu açıkça görülmektedir (daha fazla tartışma için Bkz. Roelofs ve ark.9). İlk olarak, DRaCALA, (p)ppGpp'nin kimyasal yapısını etkilemeyen ve böylece potansiyel hedef proteinlerle etkileşimini koruyan 32P etiketli (p)ppGpp'yi kullanır. İkincisi, 32p-(p)ppGpp ve hücre lysates hazırlandıktan sonra, DRaCALA kullanarak E. coli ORFeome kütüphanesinin ~ 60 plakasını taramak sadece bir hafta sürer. Gerçekten de, kısa deneysel prosedür (bölüm 4), yakalama bileşik tekniğininkaçırdığı(p)ppGpp (MutT, NudG)12,17' yi bozan proteinlerin bile tanımlanmasına izin verdi.
Bununla birlikte, DRaCALA kullanımı, yalnızca sınırlı sayıda model organizma için kullanılabilen bir ORFeome ifade kitaplığı gerektirir. Ayrıca, ORFeome kütüphanesindeki protein saflaştırmayı kolaylaştırmak için tasarlanan benzeşim saflaştırma etiketleri, bazen proteinlerin ekspresyonini veya uygun şekilde katlanmasını etkileyerek bazı yanlış negatifler üretir. Yeni bir ORFeome kütüphanesi, proteinlerin çoğunluğunun (%>80) çözünür formda ve yeterli miktarda ifade edilip edilmediği konusunda ideal olarak belirlenmesini gerektirecektir. Böyle bir test, araştırmacıların DRaCALA tarama sonuçlarının kapsamını ve etkinliğini değerlendirmelerini de sağlar.
Bu sınırlamalara rağmen, DRaCALA birkaç nükleotid ikincil habercinin yeni hedef proteinlerini başarılı bir şekilde ortaya çıkarmak için güçlü bir tekniktir. Prensip olarak, DRaCALA radyoaktif izotoplar ve hatta floresan boyalar kullanılarak etiketlenebiliyorsa, herhangi bir küçük ligand'ı incelemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Çalışma, YEZ'e bir NNF Proje Hibesi (NNF19OC0058331) ve MlS'e Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması (Nº 801199) kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32P-α-GTP | Perkinelmer | BLU006X250UC | |
| 96 x pin tool | V&P Scientific | VP 404 | 96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long |
| 96-well V-bottom microtiter plate | Sterilin | MIC9004 | Sterilin Microplate V Well 611V96 |
| Agar | OXOID - Thermo Fisher | LP0011 | Agar no. 1 |
| ASKA collection strain | NBRP, SHIGEN, JAPAN | Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012 | |
| Benzonase | SIGMA | E1014-25KU | genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens |
| Bradford Protein Assay Dye | Bio-Rad | 5000006 | Reagent Concentrate |
| DMSO | SIGMA | D8418 | ≥99.9% |
| DNase 1 | SIGMA | DN25-1G | |
| gel filtration10x300 column | GE Healthcare | 28990944 | contains 20% ethanol as preservative |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1214 | Glycerol 87% for analysis |
| Hypercassette | Amersham | RPN 11647 | 20 x 40 cm |
| Imidazole | SIGMA | 56750 | puriss. p.a., ≥ 99.5% (GC) |
| IP Storage Phosphor Screen | FUJIFILM | 28956474 | BAS-MS 2040 20x 40 cm |
| Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | SIGMA | I6758 | Isopropyl β-D-thiogalactoside |
| Lysogeny Broth (LB) | Invitrogen - Thermo Fisher | 12795027 | Miller's LB Broth Base |
| Lysozyme | SIGMA | L4949 | from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, ≥98% |
| MgCl2 (Magnesium chloride) | SIGMA | 208337 | |
| MilliQ water | ultrapure water | ||
| multichannel pipette | Thermo Scientific | 4661110 | F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810 | AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur. |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30230 | |
| Nitrocellulose Blotting Membrane | Amersham Protran | 10600003 | Premium 0.45 um 300 mm x 4 m |
| PBS | OXOID - Thermo Fisher | BR0014G | Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets |
| PEG3350 (Polyethylene glycol 3350) | SIGMA | 202444 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | SIGMA | 93482 | Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T) |
| Phosphor-imager | GE Healthcare | 28955809 | Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager |
| Pipette Tips, filtered | Thermo Scientific | 94410040 | ClipTip 12.5 μl nonsterile |
| Poly-Prep Chromatography column | Bio-Rad | 7311550 | polypropylene chromatography column |
| Protease inhibitor Mini | Pierce | A32955 | Tablets, EDTA-free |
| screw cap tube | Thermo Scientific | 3488 | Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile |
| SLS 96-deep Well plates | Greiner | 780285 | MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural |
| spin column | Millipore | UFC500396 | Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer C |
| TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates) | Merck Millipore | 105579 | DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm) |
| Tris | SIGMA | BP152 | Tris Base for Molecular Biology |
| Tween 20 | SIGMA | P1379 | viscous non-ionic detergent |
| β-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | 99% (GC/titration) |
References
- Kalia, D., et al. Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis. Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).
- Camilli, A., Bassler, B. L.
- Luo, Y., et al. The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).
- Laventie, B. J., et al. Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins. Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).
- Zhang, Y., et al. Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).
- Corrigan, R. M., et al. Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).
- Roelofs, K. G., et al. Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems. PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).
- Fang, X., et al. GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria. Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).
- Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).
- Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli. Mbio. 9 (2), 02188 (2018).
- Yang, J., et al. The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp. Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).
- Orr, M. W., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria. Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).
- Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research. DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).
- Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate. Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).
- Zhang, Y. E., et al. p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch. Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).
- Wang, B., et al. Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp. Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).
