המחקר הנוכחי מספק פרוטוקולים מפורטים במבחנה בכל מקום לבדיקת אנליזה לניתוח של E3 אוביקוויטין פעילות קטליטית ligase. חלבונים רקומביננטיים באו לידי ביטוי במערכות פרוקריוטיות כגון תרבות קולי Escherichia.
החיבור הקוולנטי של אוביקוויטין (Ub) לשאריות ליזינה פנימיות של חלבון מצע, תהליך המכונה בכל מקום, מייצג את אחד השינויים הפוסט-תרגומיים החשובים ביותר באורגניזמים אאוקריוטים. Ubiquitylation מתווך על ידי מפל רציף של שלושה מחלקות אנזימים כולל אנזימים מפעילי אוביקוויטין (אנזימי E1), אנזימים ההולכים אוביקוויטין (אנזימי E2) ורצועות אוביקוויטין (אנזימי E3), ולפעמים, גורמי התארכות בשרשרת אוביקוויטין (אנזימי E4). כאן, בפרוטוקולים במבחנה לבדיקות בכל מקום מסופקים, המאפשרים הערכה של E3 אוביקוויטין פעילות ligase, שיתוף הפעולה בין זוגות E2-E3, ובחירת מצע. זוגות E2-E3 שיתופיים יכולים להיות מוקרנים על ידי ניטור הדור של רשתות פולי-אוביקוויטין בחינם ו / או כל מקום אוטומטי של ligase E3. מצע בכל העולם מוגדר על ידי כריכה סלקטיבית של ligase E3 והוא יכול להיות מזוהה על ידי סופג מערבי של התגובה במבחנה. יתר על כן, E2 ~ Ub פריקה בדיקה מתוארת, המהווה כלי שימושי להערכה ישירה של שיתוף פעולה פונקציונלי E2-E3. כאן, העברה תלויה E3 של אוביקוויטין מתבצעת מן האנזים E2 המתאים על חומצות אמינו ליצין חינם (חיקוי מצע בכל מקום) או ליזינים פנימיים של E3 ligase עצמו (auto-בכל מקום). לסיכום, שלושה פרוטוקולי במבחנה שונים מסופקים כי הם מהירים וקלים לביצוע כדי לטפל בפונקציונליות קטליטית E3 ligase.
בכל מקום הוא התהליך שבו Ub מקושר באופן קוולנטי לחלבוןמצע 1. שינוי Ub מזורז על ידי תגובות אנזימטיות רצופות המערבות פעולה של שלושה מחלקות אנזימים שונות, כלומר., אנזימים מפעילי Ub (E1s), אנזימים ההולכים ub (E2s), ליגסות Ub (E3s) ואולי גורמי התארכות שרשרת Ub (E4s)2,3,4,5. לאחר אדנוסין טריפוספט (ATP)- ומגנזיום (Mg2 +) הפעלה תלויה של Ub על ידי E1, האתר הפעיל ציסטאין של E1 תוקף את גליצין C-מסוף של Ub, ויוצר קומפלקס thioester (Ub ~ E1). האנרגיה שנשאבת מהידרוליזה ATP גורמת ל- Ub להגיע למצב מעבר באנרגיה גבוהה, אשר נשמר לאורך מפל האנזים הבא. לאחר מכן, האנזים E2 מעביר את Ub מופעל לציסטאין הקטליטי הפנימי שלו, ובכך יוצר קשר Ub ~ E2 תיאסטר חולף. לאחר מכן, Ub מועבר לחלבון המצע.
זה יכול להיעשות בשתי דרכים. ייתכן שהליגאז E3 ייקשר תחילה ל- E2, או שליגאז E3 יכול לאגד ישירות את Ub. הדרך האחרונה גורמת להיווצרות של E3 ~ Ub ביניים. בכל מקרה, Ub מקושר לחלבון המצע על ידי היווצרות קשר איזופפטיד בין קבוצת קרבוקסיל C-terminal של Ub לבין קבוצת האמינו ליסין Ɛ של המצע6. הגנום האנושי מקודד שני E1s, כ 40 E2s, ויותר מ 600 פוטטיבי בכל מקום רצועות7. בהתבסס על מנגנון העברת Ub של E3, רצועות Ub מחולקות לשלוש קטגוריות המערבות הומולוגית לסוג E6AP C-Terminus (HECT), גן חדש מעניין באמת (RING)/U-box- type, וטבעת בין רצועות מסוג RING (RBR)8. במחקר זה, U-box המכיל ליגאז, טרמינל קרבוקסיל של חלבון אינטראקציה HSC70 (CHIP), משמש כאנזים E3 מייצג. בניגוד לאנזימי E3 מסוג HECT היוצרים Ub ~ E3 thioesters, תחום U-box של CHIP קושר E2 ~ Ub ומקדם את העברת Ub / מצע הבאים ישירות מן האנזים E28,9. בהתבסס על החשיבות של תיבת U עבור פונקציה אנזימטית, מוטציה U-box שבב לא פעיל, CHIP(H260Q), משמש כפקד. CHIP(H260Q) אינו מצליח להיקשר ל- E2s הקוגנייט שלו, ובכך מאבד את פעילות ה- E3 ligase10.
בכל מקום חלבון ממלא תפקיד מכריע בוויסות שפע של אירועים תאיים בתאים אאוקריוטים. ניתן לייחס את מגוון התוצאות התאיות המקודמות על ידי צירוף הפיך של מולקולות Ub לחלבונים מצעיים למאפיינים המולקולריים של Ub. כמו Ub עצמו מכיל שבעה שאריות ליסן (K) עבור כל כולה נוספת, יש מגוון עשיר של סוגי שרשרת Ub עם גדלים שונים ו / או טופולוגיות11. לדוגמה, מצעים יכולים להשתנות על ידי מולקולת Ub אחת באחת (מונו-נביקולציה) או ליזינים מרובים (multi-mono-ubiquitylation), ואפילו על ידי שרשראות Ub (פולי-ubiquitylation)11. שרשראות Ub נוצרות הומו או הטרוטיפיות באמצעות שאריות ליצין זהות או שונות של Ub, מה שעלול אף לגרום לרשתות Ub מסועפות9. לכן, כל החלבון מוביל לסידורים מגוונים של מולקולות Ub המספקות מידע ספציפי, למשל., עבור השפלה, הפעלה או לוקליזציה של חלבונים מצומדים12,13. אותות Ub שונים אלה מאפשרים תכנות מחדש מהיר של מסלולי איתות תאיים, המהווה דרישה חשובה ליכולתו של התא להגיב לצרכים הסביבתיים המשתנים.
היבט מרכזי של בכל מקום קשור לבקרת איכות חלבון. חלבונים תותומים או פגומים באופן בלתי הפיך חייבים להיות מושפלים ומוחלפים בחלבונים מסונתזים חדשים כדי לשמור על הומאוסטזיס חלבון או פרוטאוסטזיס14. בקרת האיכות E3 ligase, CHIP, משתפת פעולה עם מלווים מולקולריים בהשפלה תלוית Ub של חלבונים פגומים9,15,16,17. חוץ מזה, CHIP מווסת את היציבות של המלווה מכוון מיוסין, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), אשר מתואם היטב עם תפקוד שרירים וחריגות מהרמות האופטימליות להוביל מיופתיה אנושית18,19,20,21. השפלה של UNC-45B על ידי פרוטאסום 26S הוא בתיווך על ידי התקשרות של שרשרת פולי-Ub הקשורה K489. בהיעדר חלבוני מצע, CHIP מבצעת10,22,23,המאפיין את רינג / U-box E3 רצועות אוביקוויטין24,25 ונחשב לווסת פעילות ligase26. יישום שיטות בדיקת ההחמצה המופרכות המתוארות במאמר זה סייע לזהות באופן שיטתי אנזימי E2 המשתלבים עם CHIP כדי לקדם היווצרות של שרשראות פולי-Ub בחינם ו/או כל-כל אוטומטי של CHIP (פרוטוקול סעיף 2). יתר על כן, כל מקום תלוי שבב של UNC-45B נצפתה, שהוא מצע ידוע של E3 ligase18,19 (פרוטוקול סעיף 3). בסופו של דבר, העברה תלוית שבב של Ub מופעל מן Ub ~ E2 thioester היה במעקב (פרוטוקול סעיף 4).
מאמר זה מתאר שיטות בסיסיות במבחנה בכל העולם לניתוח של פונקציית ligase E3. בעת ביצוע במבחנה בכל מקום בדיקות, יש לקחת בחשבון כי כמה אנזימי E2 יכולים לבצע auto-בכל מקום בשל ההתקפה של ציסטאין הפעיל שלהם על שאריות ליצין שלהם הממוקמים בסמיכות לאתר הפעיל30. כדי לעקוף בעיה זו, השימוש …
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לחברי המעבדה שלנו על דיון ביקורתי ועצות מועילות על כתב היד. אנו מתנצלים על כך שלא ציינו תרומות יקרות ערך בשל מגבלת גודל. עבודה זו נתמכת על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 ואשכול מצוינות EXC 229 / CECAD ל- TH. עבודה זו מומנה על ידי דויטשה פורשונגסגמיינסכאפט (DFG, קרן המחקר הגרמנית) תחת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה – EXC 2030 – 390661388 ו – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 to T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie – EXC 2030 – 390661388 und – SFB 1218 – Projektnummer: 269925409 a T.H. gefördert.
Amershan Protran 0.1 µm NC | GE Healthcare | 10600000 | nitrocellulose membrane |
Anti-CHIP | Cell Signaling | 2080 | Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6 |
Anti-MYC | Roche | OP10 | Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10 |
Anti-ubiquitin | Upstate | 05-944 | Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11 |
Apyrase | Sigma | A6535-100UN | |
ATP (10x) | Enzo | 12091903 | |
BSA | Sigma | A6003-10G | |
EDTA | Roth | 8043.2 | |
KCl | Roth | 6781.1 | |
K2HPO4 | Roth | P749.2 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
LDS sample buffer (4x) | novex | B0007 | |
L-Lysine | Sigma | L5501-5G | |
MES | Roth | 4256.4 | |
MeOH | VWR Chemicals | 2,08,47,307 | 100% |
Milchpulver | Roth | T145.3 | |
NaCl | Roth | P029.3 | |
NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | |
NuPAGE Transfer buffer (20x) | novex | NP0006-1 | |
Page ruler plus | Thermo Fisher | 26619 | Protein ladder |
RotiBlock | Roth | A151.1 | Blocking reagent |
SDS (20%) | Roth | 1057.1 | |
S1000 Thermal Cycler | Bio Rad | 1852196 | |
Trans-Blot Turbo | Bio Rad | 1704150EDU | Transfer system |
Tris base | Roth | 4855.3 | |
Tween 20 | Roth | 9127.2 | |
UbcH Enzyme Set | BostonBiochem | K-980B | E2 enzymes |
Ubiquitin | BostonBiochem | U-100H | |
Ubiquitin-activating enzyme E1 | Enzo | BML-UW941U-0050 | |
Ubiquitylation buffer (10x) | Enzo | BML-KW9885-001 | |
Whatman blotting paper | Bio Rad | 1703969 | Extra thick filter paper |