ApoE에서 뒷다리 허혈의 변형 된 수술 모델-/- 소형 절개를 사용하여 마우스

Summary

이 문서는 작은 절개를 가진 마우스에 있는 심각한 허혈을 확립하기 위하여 능률적인 외과 접근을 보여줍니다. 이 방법은 실험실 업그레이드없이 대부분의 연구 그룹에 의해 적용 될 수있다.

Abstract

이 연구의 목적은 대부분의 동물 실험실에서 구현 될 수있는 마우스에서 급성 허혈을 유도하기 위해 수정 된 수술 방법을 도입하고 평가하는 것입니다. 대퇴동맥(DLFA)의 이중 결찰에 대한 기존의 접근법과는 달리, DLFA를 수행하기 위해 근위 대퇴동맥(FA)을 노출시키기 위해 올바른 인게날 부위에 대한 작은 절개가 이루어졌다. 이어서, 7-0 봉합사를 사용하여, 절개는 말단 FA를 노출하기 위해 무릎 영역으로 끌려갔다. 수술 후 0, 1, 3, 5 및 7일 동안, 뒷사지의 기능적 회복은 탈로프 스케일을 사용하여 시각적으로 평가되고 등급화되었다. 히스토로지평가는 DLFA 이후 7일 후에 동물을 안락사한 후 수행되었다. 절차는 성공적으로 10 ApoE^-/- 마우스에 있는 오른쪽 다리에, 그리고 어떤 마우스는 후속 관찰 도중 정지했습니다. 10마리의 마우스 의 절개 크기는 5mm(4.2± 0.63mm) 미만이었다. MRI 결과는 허혈성 측의 FA 혈류가 명확하게 차단되었다는 것을 보여주었습니다. Tarlov 스케일 결과는 수술 후 뒷다리 기능이 현저히 감소하고 다음 7일 동안 서서히 회복되었다는 것을 보여주었습니다. 조직학적 평가는 허혈성 측에 상당한 염증 반응을 보였고 허혈성 뒷두발의 미세 혈관 밀도를 감소시키는 것으로 나타났다. 결론적으로, 이 연구는 DLFA를 사용하여 뒷다리 허혈 (HLI)을 수행하기 위해 소형 절개를 사용하여 수정 된 기술을 소개합니다.

Introduction

말초 동맥 질환 (PAD)과 같은 혈관 질환연구를 위한 전임상 동물 모델에 대한 충족되지 않은 필요성이 있습니다. 진단 및 치료의 고급 발달에도 불구하고 2018 년¹에서 PAD를 가진 2 억 명 이상의 환자가 있었고 그 수는 지속적으로 증가하고 있습니다. 비록 몇몇 새로운 치료 접근법^{2,3,4,5,6,7이} 기술되었지만, 이러한 치료 양식의 성공적인 번역을 임상 응용 프로그램으로 성공적으로 번역하는 것은 어려운 작업으로 남아 있다. 따라서, 인간 질환 상태를 시뮬레이션하는 생체 내 실험 모델에서 안정적이고 관련성이 높은 이러한 새로운 치료 접근법의 잠재적 기전및 효율을 조사하여 PAD^6,7을치료해야 한다.

고지혈증과 죽상 경화증 (AS)은 PAD의 발달을위한 주요 위험 요소입니다. ^ApoE-/– 마우스(고지방 식단)는 비정상적인 지방 대사와 고지혈증을 표시하고, 이후^{ApoE-/-마우스를} 임상적으로 관련 있는 PAD를 시뮬레이션하는 최선의 선택으로 동맥 경화성 플라크를 개발한다. 전임상 HLI 동물 모델은 전 세계^{8, 9,10, 11,12,13,14,15에} 걸쳐 실험실에서 가장 널리 사용되는 접근법인 대퇴동맥(DLFA)의 이중 결찰을 통해 생성된다. 그러나, 이 접근은 일반적으로 상대적으로 크고 침략적인 절개를 요구합니다. 더욱이, 그것은 필연적으로 증가 된 통증 손상 및 염증으로 고통받는 동물 (특히 마우스)으로 이어지며, 이는 또한 후속 실험 결과에 영향을 미치는^5,6,16,17. 이 논문은 매우 작은 절개를 사용하여^{APOE-/-마우스의} 급성 만성 HLI 모델을 설명합니다.

Protocol

참고: 모든 실험 절차는 EC 지침 EC 2010/63/EU에 따라 수행되었으며 현지 독일 법률(35-9185.81/G[1]239/18)의 승인을 받았습니다. C57BL/6J 배경이 29.6-38.0g인 10마리의 수컷 아포에 마우스는 12시간 광/암흑주기에 보관되어 서양 식단(콜레스테롤 1.25%, 지방 21%)과 8주 부터 12주 동안 물 광고 리비툼을 공급하였다. HLI는 아래에 설명된 바와 같이 20주 된 마우스에 수행되었다. 1. Ap…

Representative Results

아포에의 특성-/– 마우스DLFA 수술은 HLI 모델을 확립하기 위해 10마리의 마우스에서 성공적으로 수행되었으며, 수술 후 마우스 중 누구도 사망하지 않았습니다. 체중의 변화를 따르기 위해, 마우스는 DLFA 절차 (PRE DLFA) 및 DLFA 수술 후 7 일 전에 무게를 측정했다 (포스트 DLFA). 사전 DLFA 가중치는 29.6에서 38.0g(평균 34.74 ± 2.47g)이며, DLFA 이후 의 무게는 26…

Discussion

이 연구는 필요한 실험실 업그레이드없이 3-4mm 절개를 통해 FA의 근위 및 탈산 영역에서 이중 결찰을 사용하여^{ApoE-/-마우스에} HLI 모델을 확립하기 위한 수정, 단순화 및 외과 효율적인 접근법을 보고합니다. 이 방법의 주요 특징은 마우스 HLI 모델^{8,9,10,11,12,…}

Materials

10x Phosphate buffer saline	Roth	9143.1	Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
30% H2O2	Roth	9681.2	Used for immunohistochemistry stain
6-0 absorbable sutures	PROLENE	8776H	Used for stitching the skin
6-0 absroable suture	PROLENE	EP8706	Used in Surgery
7-0 absorbable sutures	PROLENE	EH8021E	Used for ligating the artery
7-0 absroable suture	PROLENE	EP8755	Used in Surgery
Acetic acid	Roth	6755.1	Used for haematoxylin and eosin stain
Albumin Fraktion V	Roth	8076.2	Used for immunohistochemistry stain
Autoclave	Systec GmbH	Systec VX-150	Used for the sterilisation of the surgical instruments
Axio vert A1 microscope	Carl Zeiss	ZEISS Axio Vert.A1	Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Bruker BioSpec 94/20 AVIII	Bruker Biospin MRI GmbH	N/A	Scan the femoral artery blockage
Buprenovet Sine 0,3mg/ml	Bayer AG	2542 (WDT)	Used in post operative pain-management. Dose – 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation
CD31 antibody	Abcam	ab28364	Used for immunohistochemistry stain
Eosin Y solution 0.5 % in water	Roth	X883.1	Used for haematoxylin and eosin stain
Epitope Retrieval Solution pH 6	Leica Biosystems	6046945	Used for immunohistochemistry stain
Ethanol ≥ 99,5 %	Roth	5054.1	Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Fentanyl	Cayman Chemical	437-38-7	Used for anesthesia
Fine point forceps	Medixplus	93-4505S	Used for separating the artery from nerve and vein
Glass bead sterilisator	Simon Keller	Type 250	Used for sterilisation of the surgical instruments
Graefe iris forceps curved	VUBU	VUBU-02-72207	Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue
Hair Remover cream, Veet (with aloe vera)	Reckitt Benckiser	108972	Remove hair from mice hind limbs
Heating plate	STÖRK-TRONIC	7042092	Keep the satble temperature of mice
Hematoxylin	Roth	T865.2	Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Leica surgical microscope	Leica	M651	Enlarge the field of view to facilitate the operation
Liquid DAB+Substrate Chromogen System	Dako	K3468	Used for immunohistochemistry stain
Male ApoE-/- mice	Charles River Laboratories	N/A	Used for establish the Peripheral artery disease mice model
Medetomidine	Cayman Chemical	128366-50-7	Used for anesthesia
Micro Needle Holder	Black & Black Surgical	B3B-18-8	Holding the needle
Micro suture tying forceps	Life Saver Surgical Industries	PS-MSF-145	Used to assist in knotting during surgery
Microtome	Biobase	Bk-Mt268m	Used for tissue sectioning
Midazolam	Ratiopharm	44856.01.00	Used for anesthesia
MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025	SA Instruments	N/a	monitoring vital signs of animal during MRI scan
Octeniderm farblos	Schülke & Mayr GmbH	180212	used for disinfection of the skin
Ointment for the eyes and nose	Bayer AG	1578675	Keep the eyes wet under the anesthesia
Paraformaldehyde	Roth	0335.1	Used for fixation of the tissue
Pentobarbital	Nembutal	76-74-4	Used for anesthesia
Saline	DeltaSelect	1299.99.99	Used for anesthesia
Spring handle scissors with fine, sharp tips	Black & Black Surgical	B66167	Used for cutting the artery
SuperCut Scissors	Black & Black Surgical	B55992	Used for cutting the skin
Triton X-100	Roth	9002-93-1	Used for immunohistochemistry stain
Western diet, 1.25% Cholesterol	ssniff Spezialdiäten GmbH	E15723-34	Diet for the mice
Xylene	Roth	4436.3	Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain