Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Иммунофлуоресцентное окрашивание для визуализации гетерохроматиновых ассоциированных белков в слюнных железах дрозофилы

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62408
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biotecnología, Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Universidad Nacional Autónoma de México

Summary

Этот протокол направлен на визуализацию агрегатов гетерохроматина в клетках Drosophila polytene.

Abstract

Визуализация агрегатов гетерохроматина путем иммуноокрашивания может быть сложной задачей. Многие компоненты хроматина у млекопитающих сохраняются в Drosophila melanogaster. Поэтому это отличная модель для изучения образования и поддержания гетерохроматина. Политенизированные клетки, такие как те, которые обнаружены в слюнных железах личинок третьей звезды D. melanogaster, обеспечивают отличный инструмент для наблюдения за усилением хроматина почти в тысячу раз и позволили исследователям изучить изменения в распределении гетерохроматина в ядре. Хотя наблюдение за компонентами гетерохроматина может проводиться непосредственно в политеновых хромосомных препаратах, локализация некоторых белков может быть изменена тяжестью лечения. Поэтому прямая визуализация гетерохроматина в клетках дополняет этот вид исследования. В этом протоколе мы описываем методы иммуноокрашения, используемые для этой ткани, использование вторичных флуоресцентных антител и конфокальную микроскопию для наблюдения этих гетерохроматиновых агрегатов с большей точностью и детализацией.

Introduction

Начиная с ранних исследований Эмиля Хайца1,гетерохроматин считался важным регулятором клеточных процессов, таких как экспрессия генов, мейотическое и митотическое разделение хромосом и поддержание стабильности генома2,3,4.

Гетерохроматин в основном делится на два типа: конститутивный гетерохроматин, который характерно определяет повторяющиеся последовательности, и транспонируемые элементы, которые присутствуют в определенных участках хромосом, таких как теломеры и центромеры. Этот тип гетерохроматина в основном определяется эпигенетически специфическими гистоновыми метками, такими как ди- или триметилирование лизина 9 гистона H3 (H3K9me3) и связывание белка гетерохроматина 1a (HP1a)5,6. С другой стороны, факультативный гетерохроматин локализуется через руки хромосомы и состоит в основном из генов, заглушающих развитие7,8. Иммуноокрашивание блоков гетерохроматина в метафазных клетках или наблюдение за агрегатами гетерохроматина в межфазных клетках открыло много света в понимании формирования и функции гетерохроматических областей9.

Использование дрозофилы в качестве модельной системы позволило разработать необходимые инструменты для изучения гетерохроматина без использования электронной микроскопии10. С момента описания изменения эффекта положения и открытия гетерохроматин-ассоциированных белков, таких как HP1a, и постпереводных модификаций гистона многие группы разработали несколько иммуногистохимических методов, которые позволяют визуализировать эти гетерохроматическиеобласти 10,11.

Эти методы основаны на использовании специфических антител, которые распознают гетерохроматин-ассоциированные белки или гистоновые метки. Для каждого типа клеток и антител условия фиксации и пермеабилизации должны быть определены эмпирически. Кроме того, условия могут варьироваться, если используются дополнительные механические процессы, такие как методы раздавливания. В этом протоколе мы описываем использование слюнных желез Drosophila для изучения гетерохроматических очагов. Слюнные железы имеют политенизированные клетки, которые содержат более 1000 копий генома, что обеспечивает усиленное представление о большинстве особенностей хроматина, за исключением спутниковой ДНК и некоторых гетерохроматических областей, которые недостаточно реплицируются. Тем не менее, области гетерохроматина легко визуализируются в препаратах политеновых хромосом, но методы раздавливания могут иногда нарушать характерные хроматин-связанные комплексы или архитектуру хроматина. Поэтому иммунолокализация белков в целой ткани слюнных желез может превзойти эти нежелательные эффекты. Мы использовали этот протокол для обнаружения нескольких связанных с хроматином белков, и мы продемонстрировали, что этот протокол в сочетании с мутантными запасами дрозофилы может быть использован для изучения нарушения гетерохроматина12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Третья культура личинок

  1. Приготовить 1 л стандартной среды, добавив 100 г дрожжей, 100 г нерафинированного цельного тростникового сахара, 16 г агара, 10 мл пропионовой кислоты и 14 г желатина. Растворите все ингредиенты, кроме дрожжей, в 800 мл водопроводной воды, а затем растворите дрожжи. Автоклав сразу на 30 минут.
    1. После этого дайте среде остыть до 60 °C и добавьте пропионовую кислоту до конечной концентрации 0,01%. Дайте флакону постоять, пока не образуется желатин.
  2. Чтобы оптимизировать культуру 3o instar larvae, сначала соберите взрослых особей в возрасте от 5 до 10 дней и поместите 50 (25 самцов и 25 самок) в бутылку со стандартными носителями с широким горлышком.
  3. Поместите бутылку с мухами в инкубатор с контролируемой температурой при 25 °C до тех пор, пока количество отложенных яиц не сойдет на 50 (примерно 12 часов для штамма дикого типа).
  4. После того, как время инкубации закончится, удалите взрослых и перенесите их в новый флакон, чтобы повторить процедуру. Дайте эмбрионам расти при 18 °C в течение 72 часов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной о состоянии обслуживания запасов дрозофилы см. Tennessen & Thymmel13.

2. Сбор личинок

  1. Для сбора личинок выбирают блуждающих личинок, у которых нет вечно хихищевиц. После выворота дыхальца личинка переходит в препупальную стадию, сохраняя при этом отличные политеновые хромосомы, пригодные для анализа. Только через 12 часов клетки слюнных желез начинают готовиться к запрограммированной гибели клеток14,15.
  2. Возьмите пятнадцать личинок звезды 3° и положите их в стакан для часов, чтобы промыть их. Затем переложите их в ледяной солевой раствор или PBS (1x PBS: 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4,2 мМ KH2PO4,отрегулируйте рН до 7,4).
  3. Рассечение от 15 до 30 пар слюнных желез (или как можно больше за 30 минут) в холодном PBS с ингибиторами протеазы под стереоскопическим микроскопом. Перенесите слюнные железы в трубку 1,5 мл с ледяным PBS.
  4. Промыть один раз 1 мл PBS плюс ингибиторы протеазы. Подождите, пока ткань достигнет дна трубки.
  5. После стирки удалите PBS пипеткой 1000 мкл. Позаботьтесь о том, чтобы не прикасаться к ткани.
    1. Альтернативно, рассекните слюнные железы в 5 мл PBS, чтобы устранить необходимость в этом этапе промывания, и перейдите к шагу 3, переведя слюнные железы в 0,5 мл фиксирующего буфера Ruvkun, описанного ниже.

3. Фиксация тканей слюнных желез

  1. После удаления PBS с последней ступени непосредственно добавляют 0,5 мл 1x фиксирующего буфера Ruvkun, с 50% метанола (добавляют 0,5 мл метанола) и 2% формальдегида.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 2x раствор Ruvkun составляет 160 мМ KCl, 40 мМ NaCl, 20 мМ EGTA, 30 мМ ТРУБЫ при рН 7,4.
  2. Инкубировать в течение 2 часов при 4 °C с легким вращением.

4. Промывание тканей слюнных желез

  1. Проводят одну 5-минутную ротационную промывку с 1 мл буфера Tris/Triton (100 мМ Tris pH 7,4, 1% Triton X-100 и 1 мМ ЭДТА).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите, пока ткань достигнет дна трубки.

5. Пермеабилизация

  1. Инкубировать слюнные железы в 1 мл Tris/Triton X-100 (так же, как и выше). Для некоторых белков может потребоваться добавить 1% β-меркаптоэтанола.
  2. Инкубировать в течение 2 часов при 37°С при легком встряхивании (300 об/мин).

6. Шаг сохранения (опционально)

ПРИМЕЧАНИЕ: Если не приступаем непосредственно к инкубации с антителом, сохраните ткань следующим образом.

  1. Промыть 1 мл буфера BO3 (0,01 M H3BO3 pH 9,2 + 0,01 M NaOH) и затем инкубировать в BO3 /10мМ DTT при 37 °C с легким встряхиванием (300 об/мин) в течение 15 минут.
  2. В конце инкубационного периода выполните промывку 1 мл только буфера BO3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите, пока ткань достигнет дна трубки.
  3. Добавьте 1 мл PBS. Сохраняйте ткань в этом растворе при 4 °C в течение 72 часов, а затем переходите к следующему шагу. Этот шаг особенно полезен при работе с различными мутантными штаммами, которые могут представлять собой замедленный жизненный цикл, поэтому иммунодетекция может быть выполнена одновременно с контролем.

7. Блокировка тканей

  1. Инкубируют слюнные железы в 1 мл буфера B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 мМ ЭДТА) в течение 2 часов при комнатной температуре с вращением.

8. Иммуноокрашивание

  1. Удалите весь буфер B и добавьте буфер A (PBS + 0,1% BSA) плюс интересующих антитела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем HP1a C1A9c (концентрированное антитело) от Hybridoma Bank до 1:3000. При использовании C1A9s (супернатанта) мы попробовали от 1:100 до 1:500 разбавления, и любое разведение между этим рангом работает хорошо) ночью при 4 oC с вращением. В этот момент важно, чтобы встряхивание не поднимало пузырьки, которые могут повредить антитело.

9. Иммуноокрашивание промывки

  1. Выполняйте 3 х 15-минутные промывки с буфером B при перемешивании при комнатной температуре, используя 1 мл каждый раз.
  2. Перенос желез в буфер В вместе с вторичным антителом, соединенным с флуорофором в течение 2 часов при вращении при 4 oC (вторичное антитело Alexa fluor 568 Invitrogen использовали 1:3000).
    1. Накройте трубку алюминиевой бумажной фольгой, чтобы защитить вторичное антитело от света.
  3. Проводите 2 х 15-минутные стирки при комнатной температуре при вращении с 1 мл буфера B.
  4. Инкубировать с ДНК-маркером, таким как Sytox (взять 2 мкл из 5 мМ запаса и растворить в 1 мл буфера B) или Hoechst (взять 1 мкл из 10 мг / мл и растворить в 1 мл буфера B) в течение 10 минут при комнатной температуре с вращением.
  5. Провести одну стирку с буфером B и один раз с PBS, каждая стирка длится 10 минут при вращении при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте защитить его от света.

10. Визуализация

  1. Установите слюнные железы на горку, сделав бассейн с укрытием.
  2. Поместите слюнные железы в середину бассейна и накройте AF1 citifluor, чтобы избежать образования пузырьков, распространяющих вязкую жидкость по всему месту. Затем запечатайте все стороны прозрачным лаком для ногтей.
  3. Наблюдают под флуоресцентным или конфокальным микроскопом. Если образец не будет наблюдаться в тот же день, храните вдали от света при 4 °C.
  4. Используйте GraphPad Prism 6 для создания всех графиков и статистического анализа.
  5. Проанализируйте данные распределения HP1a в слюнных железах с помощью теста Крускала-Уоллиса. Статистическая значимость установлена на уровне (p < 0,05*, < 0,01**, < 0,001***, < 0,0001****).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Репрезентативные результаты иммуноокрашивания HP1a в слюнных железах Drosophila показаны на рисунке 1. Положительным результатом является наблюдение одной фокусной точки(рисунок 1а)(гетерохроматический агрегат или конденсат). Отрицательным результатом является отсутствие сигнала или рассеянный сигнал. Иногда может наблюдаться двойной сигнал, то есть с двойной точкой(рисунок 1с),но обычно он возникает в меньших количествах.

Анализ данных можно представить в виде гистограмм, сравнивающих распределение HP1a в пределах различных мутантных фонов. Например, на рисунке 2 мы видим, что 98% ядер дикого типа представляют собой распределение одной фокусной точки, а 2% ядер представляют два очага, тогда как у мутанта пропорция изменяется, а наличие двух очагов увеличивается до 40%.

На рисунке 3 показаны репрезентативные результаты иммуноокрашивания H3k9me3 в слюнных железах Drosophila. Мы можем наблюдать одну фокусную точку(рисунок 3b),которая напоминает иммуноокрашивание HP1a (гетерохроматический агрегат или конденсат). Двойной или тройной сигнал(рисунок 3c) можноувидеть в редких случаях в штаммах дикого типа.

Figure 1
Рисунок 1. Репрезентативное изображение конфокальной микроскопии из иммуноокрашивания слюнных желез антителом HP1a дикого типа (wt). a) ДНК (синий сигнал), HP1a (пурпурный сигнал) и шкала слияния 100 мкм. При иммуноокрашиве для HP1a ядро с фокусной точкой обозначается белой стрелкой и ядро с двумя очагами с пунктирной линией. В правой колонке показано увеличенное изображение одного ядра с масштабной планкой 5 мкм. б)фокального распределения. в)распределение двух очагов. Оба ядра отмечены белой пунктирной линией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. Примеры получены в результате подсчета очагов распространения иммуноокрашиванияHP1a. Первая полоса представляет собой подсчет ядер дикого типа (wt), как показано на рисунке 1. Вторая полоса представляет собой мутантный штамм, который влияет на это распределение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Репрезентативное изображение конфокальной микроскопии из иммуноокрашивания слюнных желез антителами H3K9me3 дикого типа (wt). a) ДНК (синий сигнал), H3K9me3 (пурпурный сигнал) и шкала слияния 100 мкм. При иммуноокрашении для H3K9me3.В правой колонке показано увеличенное изображение одного ядра с масштабной планкой 5 мкм. б)ядра с фокальным распределением. в)распределение по трем очагам. Оба ядра отмечены белой пунктирной линией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Клеточная функция эукариотических организмов может определять 3D-структуру внутри ядра, которая поддерживается взаимодействиями между различными белками с хроматином и различными молекулами, включая РНК. В последние три года биологические конденсаты, которые имели отношение, в том числе гетерохроматин, взяли на себя фундаментальную роль в определении разделения фаз, способствуя отчетливой ядерной пространственной организации активного и репрессивного хроматина 16,17,18.

Гетерохроматин необходим для сохранения функций и идентичности клеток. Ранее считалось, что эти плотные участки не транскрибируются. Однако теперь, когда у нас есть более мощные технологии, мы можем видеть, что гетерохроматин не только транскрибируется, но и является фундаментальным процессом для поддержания каркаса ядра и чувствителен к процессам развития или патологическим процессам12,19. Кроме того, некоторые гены, встроенные в перицентрический гетерохроматин, нуждаются в гетерохроматической среде для правильного функционирования. Мутации HP1a снижают экспрессию легких и свернутых генов, которые первыми были обнаружены19. Эти гены необходимы для выживания организма и находятся в блоках гетерохроматина. В результате, несмотря на свою способность вызывать глушение, этот своеобразный компонент генома может быть очень динамичным20. В сложном балансе между хроматин-связанными и диффузными типами, который может контролироваться различными биологическими контекстами, также существуют гетерохроматин-ассоциированные белки, такие как HP1a. Также недавно было высказано предположение, что свойства фазового разделения проявляются сборкой гетерохроматиновых конденсатов21,22.

Существует ряд работ, в которых авторы проводили цельноукладное иммуноокрашивание ядер слюнных желез дрозофилы с использованием различных, а иногда и более простых протоколов23,24. В этом случае мы адаптировали протокол, впервые описанный в C. elegans25,а впоследствии использованный у Drosophila слюнных желез несколькими группами26,27,28,29 и объединили его с использованием конфокальной микроскопии и мутантных организмов. Этот протокол также позволяет визуализировать различные типы белков, включая факторы транскрипции, такие как XPD, XPB и TBP27,а также гетерохроматин-связанные белки, такие как HP1a, и гистоновые метки, такие как H3K9me3, что позиционирует его как протокол для широкого использования в этой ткани. Он также имеет то преимущество, что ткань может храниться на промежуточном этапе, не влияя на полосы политенов хромосом.

Этот протокол является надежным и экономически эффективным благодаря использованию специфического антитела для просмотра белка HP1a. Критическим шагом в этом протоколе является предотвращение потери желез во время промывания и ожидания, пока ткань не вытащится. Преимущество использования слюнных желез заключается в том, что 3D-вид ядра и его конформации может быть легко получен, в отличие от метода политеновой хромосомы, который требует механического разрушения клетки и может повредить хроматин. При выполнении этого протокола следует проявлять особую осторожность во время этапов стирки. Если не выполнить тщательно, ткань сломается, и получить качественные снимки не удастся.

Чтобы оценить важность отсутствия связывания РНК с наблюдаемыми областями или белками, необходимо добавить промывку буфером С (Buffer B без ЭДТА) и добавить 100 мкМ РНКазы. Эту промывку следует проводить в течение 1 ч при 37 °C, как описано ранее. Промывка должна быть выполнена перед этапом, где добавляются молекулы для наблюдения за ДНК (между шагами 9.3 и 9.4).

Конфокальная микроскопия может показаться не очень новой методологией для решения вопросов гетерохроматиновых конденсатов25,30,но она была чрезвычайно полезна для выявления делокализации белка HP1a в ядрах Drosophila, что предполагает серьезные проблемы в структуре хроматина, которые могут быть оценены с помощью других методов более тщательно. Несмотря на свою ограниченность, он может быть использован в сочетании с микроскопией высокого разрешения в качестве первого подхода к применению новых методов для уточнения биологической активности, которая модулирует сборку, контроль и функции гетерохроматинового конденсата31. Некоторые из этих новых методологий, которые сосредоточены на молекулярных и биофизических взаимодействиях между гетерохроматином, РНК и гетерохроматин-ассоциированными белками, собраны из этого набора методов для тестирования гетерохроматиновых конденсатов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Марко Антонио Росалес Вега и Абеля Сегуру за то, что они сделали некоторые из конфокальных изображений, Кармен Муньос за подготовку к сми и доктора Артуро Пиментеля, М.C Андреса Саралеги и доктора Криса Вуда из LMNA за советы по использованию микроскопов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C 11351904 brand not critical
16% formaldehyde Thermo Scientific 28908
AF1 Citifluor Ted pella 19470 25 mL
BSA, Molecular Biology Grade Roche 10735078001 brand not critical
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free
protease inhibitors		 Merck 5892953001
Coverslip Corning CLS285022-200EA 22x22, brand not critical
DTT Sigma d9779 brand not critical
EDTA Sigma E5134 brand not critical
EGTA brand not critical
Glass slide Gold seal 3011 brand not critical
H3BO3 Baker 0084-01 brand not critical
H3K9me3 Abcam 8889
HP1a Hybridoma Bank C1A9 Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl Baker 3040-01 brand not critical
Methanol Baker 9070-03 brand not critical
NaCl Sigma 71376 brand not critical
NaOH brand not critical
PIPES brand not critical
Rotator Thermo Scientific 13-687-12Q  Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C Eppendorf 13527550 SmartBlock 1.5 mL
Tris Milipore 648311 brand not critical
Triton X-100 Sigma T8787 100 mL, brand not critical
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710 25 mL, brand not critical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berger, F. Emil Heitz, a true epigenetics pioneer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).
  2. Irick, H. A new function for heterochromatin. Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).
  3. Kasinathan, B., et al. Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila. Elife. , 1-31 (2020).
  4. Lifschytz, E., Hareven, D. Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster. Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).
  5. Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
  6. Lee, Y. C. G., et al. Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin. PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).
  7. Koryakov, D. E., et al. The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster. Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).
  8. Cao, R., et al. Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing. Science. 298 (5595), 1039 (2002).
  9. Hines, K. A., et al. Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading. Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).
  10. Elgin, S. C. R., Reuter, G. Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).
  11. Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
  12. Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription. BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).
  13. Tennessen, J. M., Thummel, C. S. Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila. Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).
  14. Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling. Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).
  15. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).
  16. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  17. Larson, A. G., Narlikar, G. J. The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation. Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).
  18. Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1α. Methods in Enzymology. , (2018).
  19. Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, aJ., Eissenberg, J. C. Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila. Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).
  20. Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster. Trends in Genetics. , (2019).
  21. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  22. Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
  23. Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes. Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).
  24. Kolesnikova, T. D., et al. Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene. Fly. 5 (3), Austin. 181-190 (2011).
  25. Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).
  26. Messina, G., et al. Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization. Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).
  27. Aguilar-Fuentes, J., et al. p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model. PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).
  28. Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes. Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).
  29. Farkaš, R., Mechler, B. M. The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response. Cell Death & Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).
  30. Zhang, P., Spradling, A. C. The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin. Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).
  31. Stormo, B. M., Fox, D. T. Polyteny: still a giant player in chromosome research. Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).

Tags

Биология Выпуск 174 Drosophila melanogaster,гетерохроматин слюнные железы хроматин иммуноокрашающий HP1a
Иммунофлуоресцентное окрашивание для визуализации гетерохроматиновых ассоциированных белков в слюнных железах <em>дрозофилы</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meyer-Nava, S., Zurita, M.,… More

Meyer-Nava, S., Zurita, M., Valadez-Graham, V. Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands. J. Vis. Exp. (174), e62408, doi:10.3791/62408 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter