Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Immunfluorescerende farvning til visualisering af heterochromatin associerede proteiner i Drosophila Spytkirtler

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62408
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biotecnología, Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Universidad Nacional Autónoma de México

Summary

Denne protokol har til formål at visualisere heterochromatin aggregater i Drosophila polytene celler.

Abstract

Visualisering af heterochromatin aggregater ved immunostaining kan være udfordrende. Mange pattedyr komponenter af kromatin er bevaret i Drosophila melanogaster. Derfor er det en fremragende model til at studere heterochromatindannelse og vedligeholdelse. Polyteniserede celler, som dem, der findes i spytkirtler af tredje instar D. melanogaster larver, giver et glimrende værktøj til at observere kromatin forstærket næsten tusind gange og har gjort det muligt for forskere at studere ændringer i fordelingen af heterochromatin i kernen. Selv om observationen af heterochromatinkomponenter kan udføres direkte i polytenkromosompræparater, kan lokaliseringen af nogle proteiner ændres ved behandlingens sværhedsgrad. Derfor supplerer den direkte visualisering af heterochromatin i celler denne type undersøgelse. I denne protokol beskriver vi de immunostainingteknikker, der anvendes til dette væv, brugen af sekundære fluorescerende antistoffer og konfokal mikroskopi for at observere disse heterochromatinaggregater med større præcision og detaljer.

Introduction

Siden de tidlige undersøgelser af Emil Heitz1, heterochromatin er blevet betragtet som en vigtig regulator af cellulære processer som genekspression, meiotisk og mitotisk adskillelse af kromosomer og opretholdelse af genomstabilitet2,3,4.

Heterochromatin er hovedsageligt opdelt i to typer: konstituerende heterochromatin, der karakteristisk definerer gentagne sekvenser, og transponerbare elementer, der er til stede på specifikke kromosomsteder såsom telomerer og centromerer. Denne type heterochromatin defineres hovedsageligt epigentisk ved specifikke histonemærker såsom di eller tri-methylering af lysin 9 af histone H3 (H3K9me3) og binding af Heterochromatinproteinet 1a (HP1a)5,6. På den anden side lokaliserer fakultets heterochromatin gennem kromosomets arme og består hovedsageligt af udviklingst bragt til tavshed gener7,8. Immunostaining af heterochromatinblokke i metafaseceller eller observation af heterochromatinaggregater i interfaseceller har afsløret meget lys i forståelsen af dannelsen og funktionen af heterokromatiske regioner9.

Brugen af Drosophila som modelsystem har gjort det muligt at udvikle vigtige værktøjer til at studere heterochromatin uden brug af elektronmikroskopi10. Siden beskrivelsen af positionseffektvariation og opdagelsen af heterochromatin-associerede proteiner, såsom HP1a, og histone postoversættelsesændringer, har mange grupper udviklet flere immunohistokemiske teknikker, der tillader visualisering af disse heterokromatiske regioner10,11.

Disse teknikker er baseret på brugen af specifikke antistoffer, der genkender heterochromatin-associerede proteiner eller histonemærker. For hver celletype og antistof skal fikserings- og gennemtrængningsbetingelserne bestemmes empirisk. Forholdene kan også variere, hvis der anvendes yderligere mekaniske processer såsom squashteknikker. I denne protokol beskriver vi brugen af Drosophila spytkirtler til at studere heterokromatisk foci. Spytkirtler har polyteniserede celler, der indeholder mere end 1.000 kopier af genomet, hvilket giver et forstærket billede af de fleste af kromatinfunktionerne, med undtagelse af satellit-DNA og nogle heterokromatiske regioner, der er under replikeret. Ikke desto mindre visualiseres heterochromatinområder let i polytene kromosompræparater, men squashteknikkerne kan undertiden forstyrre karakteristiske chromatin-bundne komplekser eller chromatinarkitekturen. Derfor kan immunolocalisering af proteiner i hele spytkirtelvæv overgå disse uønskede virkninger. Vi har brugt denne protokol til at opdage flere chromatinbundne proteiner, og vi har vist, at denne protokol kombineret med mutante Drosophila-bestande kan bruges til at studere heterochromatinforstyrrelser12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tredje instar larver kultur

  1. Forbered 1 liter standardmedier ved at tilsætte 100 g gær, 100 g uraffineret hele rørsukker, 16 g agar, 10 ml propionsyre og 14 g gelatine. Opløs alle ingredienser undtagen gær i 800 mL vand fra hanen og derefter opløse gær. Autoklave straks i 30 minutter.
    1. Lad derefter mediet køle ned til 60 °C og tilsæt propionsyre til en endelig koncentration 0,01%. Lad flasken stå, indtil gelatinen er dannet.
  2. For at optimere 3o instar larverkulturen skal du først samle 5-til-10-dages gamle voksne og placere 50 (25 mænd og 25 kvinder) i en bred halsflaske med standardmedier.
  3. Flasken anbringes med fluerne i en kontrolleret temperaturinkubator ved 25 °C, indtil antallet af æg er 50 (ca. 12 timer for stammen af vildtypen).
  4. Når inkubationstiden er forbi, skal du fjerne de voksne og overføre dem til en ny flaske for at gentage proceduren. Lad embryonerne vokse ved 18 °C i 72 timer
    BEMÆRK: For mere om Drosophila lager vedligeholdelsesforhold, se Tennessen & Thymmel13.

2. Larver samling

  1. Til larversamling skal du vælge de vandrende larver, der ikke har everted spiracles. Efter eversionen af spiraclerne kommer larven ind i den prepupale fase, samtidig med at den bevarer fremragende polytenkromosomer, der er egnede til analyse. Først efter 12 timer begynder cellerne i spytkirtlen at forberede sig til programmeret celledød14,15.
  2. Tag femten 3 ° instar larver og læg dem i et urglas for at vaske dem. Overfør dem derefter til en iskold saltvandsopløsning eller PBS (1x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, juster pH til 7,4).
  3. Disseker 15 til 30 par spytkirtler (eller så mange som muligt på 30 minutter) i kold PBS med proteasehæmmere under det stereoskopiske mikroskop. Spytkirtlerne overføres til et 1,5 mL rør med iskold PBS.
  4. Vask én gang med 1 mL PBS plus protease hæmmere. Vent på, at vævet når bunden af røret.
  5. Efter vask fjernes PBS'en med en 1000 μL pipette. Pas på ikke at røre vævet.
    1. Alternativt dissekere spytkirtlerne i 5 mL PBS for at eliminere behovet for dette vasketrin og gå videre til trin 3 ved at overføre spytkirtlerne til 0,5 mL af Ruvkun-fastgørelsesbufferen, der er beskrevet nedenfor.

3. Spytkirtel væv fiksering

  1. Efter at have fjernet PBS fra det sidste trin, tilsættes direkte 0,5 mL 1x Ruvkun-fastgørelsesbuffer med 50% methanol (tilsæt 0,5 mL methanol) og 2% formaldehyd.
    BEMÆRK: 2x Ruvkun opløsning er 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM PIPES ved pH 7.4.
  2. Inkuber i 2 timer ved 4 °C med mild rotation.

4. Spytkirtel væv vask

  1. Udfør en 5-minutters rotationsvask med 1 mL Tris/Triton buffer (100 mM Tris pH 7,4, 1% Triton X-100 og 1 mM EDTA).
    BEMÆRK: Vent på, at vævet når bunden af røret.

5. Gennemtrængning

  1. Inkubat spytkirtlerne i 1 mL Tris/Triton X-100 (det samme som ovenfor). For nogle proteiner kan det være nødvendigt at tilføje 1% β mercaptoethanol.
  2. Inkuber i 2 timer ved 37 ° C med mild rysten (300 omdrejninger i minuttet).

6. Bevaringstrin (valgfrit)

BEMÆRK: Hvis du ikke straks går videre til inkubationen med antistoffet, skal du bevare vævet på følgende måde.

  1. Vask med 1 mL BO3 buffer (0,01 M H3BO3 pH 9,2 + 0,01 M NaOH) og inkubter derefter i BO3/10 mM DTT ved 37 ° C med mild rysten (300 omdrejninger) i 15 minutter.
  2. I slutningen af inkubationsperioden skal du udføre en vask med 1 mL BO3 buffer alene.
    BEMÆRK: Vent på, at vævet når bunden af røret.
  3. Tilføj 1 mL PBS. Vævet opbevares i denne opløsning ved 4 °C i op til 72 timer, og fortsæt derefter med næste trin. Dette trin er især nyttigt, når du arbejder med forskellige mutantstammer, der kan udgøre en forsinket livscyklus, så immunodesektionen kan udføres på samme tid sammen med kontrollerne.

7. Vævsblokering

  1. Rug spytkirtlerne i 1 mL Buffer B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 mM EDTA) i 2 timer ved stuetemperatur med rotation.

8. Immunostaining

  1. Fjern alle buffer B og tilsæt buffer A (PBS + 0,1% BSA) plus antistof af interesse.
    BEMÆRK: Vi bruger HP1a C1A9c (koncentreret antistof) fra Hybridoma Bank op til 1:3000. Når du bruger C1A9s (supernatant) vi har prøvet fra 1:100 til en 1:500 fortynding og enhver fortynding mellem denne rang fungerer godt) natten over på 4 oC med rotation. På dette tidspunkt er det vigtigt, at rystelserne ikke hæver bobler, der kan beskadige antistoffet.

9. Immunostaining vask

  1. Udfør 3 x 15-minutters vask med buffer B under omrøring ved stuetemperatur med 1 mL hver gang.
  2. Overfør kirtlerne til buffer B sammen med det sekundære antistof koblet til en fluorophore i 2 timer under rotation ved 4 oC (sekundært antistof Alexa fluor 568 Invitrogen blev brugt 1:3000).
    1. Dæk røret med aluminiumspapirfolie for at beskytte det sekundære antistof mod lyset.
  3. Udfør 2 x 15-minutters vaske ved stuetemperatur under rotation med 1 mL Buffer B.
  4. Inkuberes med en DNA-markør som Sytox (tag 2 μL 5 mM lager og opløses i 1 mL buffer B) eller Hoechst (tag 1 μL på 10 mg/mL lager og opløses i 1 mL buffer B) i 10 minutter ved stuetemperatur med rotation.
  5. Udfør en vask med Buffer B og en gang med PBS, hver vask varer 10 minutter, mens du roterer ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Husk at beskytte den mod lyset.

10. Billedbehandling

  1. Monter spytkirtlerne på et dias, hvilket gør en pool med en coverlip.
  2. Sæt spytkirtlerne i midten af poolen og dæk med AF1 citifluor for at undgå dannelsen af bobler, der udvider den tyktflydende væske over det hele. Derefter forsegle alle sider med klar neglelak.
  3. Overhold under en fluorescens eller konfokal mikroskop. Hvis prøven ikke skal observeres samme dag, opbevares den væk fra lyset ved 4 °C.
  4. Brug GraphPad Prism 6 til at generere alle grafer og statistiske analyser.
  5. Analyser data fra HP1a-distribution i spytkirtler ved hjælp af Kruskal-Wallis-testen. Den statistiske signifikans blev fastsat til (s. < 0,05*, < 0,01 **, < 0,001***, < 0,0001****).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative resultater af HP1a immunostaining i Drosophila spytkirtler er vist i figur 1. Et positivt resultat er at observere et omdrejningspunkt (figur 1a) (heterokromatisk aggregat eller kondensat). Et negativt resultat er intet signal eller et spredt signal. Nogle gange kan der observeres et dobbelt signal, det vil sige med et dobbeltpunkt (Figur 1c), men det forekommer normalt i mindre mængder.

Dataanalyse kan repræsenteres som søjlediagrammer og sammenligne fordelingen af HP1a inden for forskellige mutantbaggrunde. I figur 2 kan vi f.eks. se, at 98% af de vilde typekerner udgør en fordeling af et knudepunkt, og 2% af kernerne udgør to foci, mens andelen i mutanten ændres, og tilstedeværelsen af to foci stiger til 40%.

Figur 3 viser repræsentative H3k9me3 immunostaining resultater i Drosophila spytkirtler. Vi kan observere et omdrejningspunkt (Figur 3b), der ligner HP1a immunostaining, (heterokromatisk aggregat eller kondensat). Et dobbelt eller tredobbelt signal (Figur 3c) kan ses i sjældne tilfælde i de vilde typestammer.

Figure 1
Figur 1. Repræsentativ confocal mikroskopi billede fra spytkirtel immunostaining med HP1a antistof fra vilde type (wt). a)DNA (cyan signal), HP1a (magenta signal) og flet skalabjælke 100 μm. Ved immunostaining for HP1a er en kerne med et brændpunkt markeret med en hvid pil og en kerne med to foci med en prikket linjeboks. Den højre kolonne viser et forstørret billede af en enkelt kerne med en skalalinje på 5 μm. b) fokalfordeling. c)to foci distribution. Begge kerner er markeret med en hvid stiplet linje. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Eksempler skyldes optælling af kerner i distributionen afHP1a immunostaining. Den første søjle repræsenterer optællingen af de vilde kerner (wt) som i figur 1. Den anden søjle repræsenterer en mutant stamme, der påvirker denne fordeling. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Repræsentativt konfokalt mikroskopibillede fra spytkirtelimostaining med H3K9me3 antistof fra vildtype (wt). a)DNA (cyan signal), H3K9me3 (magenta signal) og flet skala bar 100 μm. I immunostaining for H3K9me3.Den højre kolonne viser et forstørret billede af en enkelt kerne med en skala bar på 5 μm. b) en kerne med en brændvidde distribution. c)tre foci distribution. Begge kerner er markeret med en hvid stiplet linje. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den cellulære funktion af eukaryote organismer kan definere 3D-strukturen i kernen, som understøttes af interaktioner mellem forskellige proteiner med kromatin og forskellige molekyler, herunder RNA. I de sidste tre år har de biologiske kondensater, der har haft relevans, herunder heterochromatin, taget en grundlæggende rolle i bestemmelsen af faseadskillelse, der fremmer den særskilte nukleare rumlige organisering af aktiv og undertrykkende chromatin 16,17,18.

Heterochromatin er afgørende for at bevare cellefunktioner og identitet. Tidligere troede man, at disse tætte områder ikke blev transskriberet. Men nu hvor vi har mere kraftfulde teknologier, kan vi se, at heterochromatin ikke kun transskriberes, men også en grundlæggende proces for at opretholde kernens stillads og er følsom over for udviklingsmæssige eller patologiske processer12,19. Desuden har visse gener indlejret i pericentrisk heterochromatin brug for et heterokromatisk miljø for at fungere korrekt. HP1a mutationer reducerer ekspressionen af lyset og rullede gener, som var de første til at blive opdaget19. Disse gener er afgørende for organismens overlevelse og findes i heterochromatin blokke. Som følge heraf har denne ejendommelige genomkomponent på trods af sin evne til at fremkalde lyddæmpning potentialet til at være meget dynamisk20. I en kompleks balance mellem chromatin-bundet og diffuse typer, der kan kontrolleres af forskellige biologiske sammenhænge, heterochromatin-associerede proteiner såsom HP1a findes også. Det blev også for nylig foreslået, at faseadskillelsesegenskaber vises ved samling af heterochromatinkondensater21,22.

Der er en række papirer, hvor forfatterne udført hele mount immunostaining af Drosophila spytkirtel kerner ved hjælp af forskellige og til tider enklere protokoller23,24. I dette tilfælde har vi tilpasset en protokol først beskrevet i C. elegans25, og efterfølgende anvendes i Drosophila spytkirtler af flere grupper26,27,28,29 og kombineret det med brug af confocal mikroskopi og mutant organismer. Denne protokol tillader også visualisering af forskellige typer proteiner, herunder transskriptionsfaktorer som XPD, XPB og TBP27, men også heterochromatinbundne proteiner som HP1a og histonemærker som H3K9me3, som placerer det som en protokol til bred brug i dette væv. Det har også den fordel, at vævet kan opbevares på et mellemliggende trin uden at påvirke polytenkromosom banding.

Denne protokol er pålidelig og omkostningseffektiv på grund af brugen af et specifikt antistof til at se HP1a-proteinet. Det kritiske skridt i denne protokol er at undgå at miste kirtlerne under vask og venter på, at vævet skal bunde ud. Fordelen ved at bruge spytkirtler er, at en 3D-visning af kernen og dens kropsbygning let kan opnås i modsætning til polytenkromosomteknikken, der kræver en mekanisk forstyrrelse af cellen og kan beskadige kromatinen. Under udførelsen af denne protokol skal der udvises særlig forsigtighed under vasketrinnene. Hvis det ikke udføres omhyggeligt, vil vævet bryde, og det ville ikke være muligt at opnå billeder af høj kvalitet.

For at vurdere vigtigheden af manglende binding af RNA til de regioner eller proteiner, der observeres, er det nødvendigt at tilføje en vask med Buffer C (Buffer B uden EDTA) og tilføje 100 μM RNase. Denne vask skal udføres i 1 time ved 37 °C som tidligere beskrevet. Vask skal ske før det trin, hvor molekyler tilsættes for at observere DNA 'et (mellem trin 9.3 og 9.4).

Confocal mikroskopi kan ikke synes som en meget ny metode til at behandle spørgsmål om heterochromatin kondensater25,30, men det har været yderst nyttigt at identificere udflytning af HP1a protein i Drosophila kerner, hvilket tyder på alvorlige problemer i chromatin struktur, der kan evalueres med andre teknikker mere grundigt. På trods af sin begrænsning kan den bruges i kombination med højopløsningsmikroskopi som en første tilgang til at anvende nye teknikker til at afklare den biologiske aktivitet, der modulerer heterochromatinkondensatsamling, kontrol og funktioner31. Nogle af disse nye metoder, der fokuserer på de molekylære og biofysiske interaktioner mellem heterochromatin, RNA og heterochromatin-associerede proteiner, er indsamlet fra dette sæt metoder til at teste heterochromatinkondensater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Marco Antonio Rosales Vega og Abel Segura for at tage nogle af de konfokale billeder, Carmen Muñoz for medieforberedelse og Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui og Dr. Chris Wood fra LMNA for at få råd om brugen af mikroskoperne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C 11351904 brand not critical
16% formaldehyde Thermo Scientific 28908
AF1 Citifluor Ted pella 19470 25 mL
BSA, Molecular Biology Grade Roche 10735078001 brand not critical
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free
protease inhibitors		 Merck 5892953001
Coverslip Corning CLS285022-200EA 22x22, brand not critical
DTT Sigma d9779 brand not critical
EDTA Sigma E5134 brand not critical
EGTA brand not critical
Glass slide Gold seal 3011 brand not critical
H3BO3 Baker 0084-01 brand not critical
H3K9me3 Abcam 8889
HP1a Hybridoma Bank C1A9 Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl Baker 3040-01 brand not critical
Methanol Baker 9070-03 brand not critical
NaCl Sigma 71376 brand not critical
NaOH brand not critical
PIPES brand not critical
Rotator Thermo Scientific 13-687-12Q  Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C Eppendorf 13527550 SmartBlock 1.5 mL
Tris Milipore 648311 brand not critical
Triton X-100 Sigma T8787 100 mL, brand not critical
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710 25 mL, brand not critical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berger, F. Emil Heitz, a true epigenetics pioneer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).
  2. Irick, H. A new function for heterochromatin. Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).
  3. Kasinathan, B., et al. Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila. Elife. , 1-31 (2020).
  4. Lifschytz, E., Hareven, D. Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster. Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).
  5. Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
  6. Lee, Y. C. G., et al. Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin. PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).
  7. Koryakov, D. E., et al. The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster. Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).
  8. Cao, R., et al. Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing. Science. 298 (5595), 1039 (2002).
  9. Hines, K. A., et al. Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading. Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).
  10. Elgin, S. C. R., Reuter, G. Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).
  11. Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
  12. Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription. BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).
  13. Tennessen, J. M., Thummel, C. S. Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila. Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).
  14. Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling. Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).
  15. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).
  16. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  17. Larson, A. G., Narlikar, G. J. The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation. Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).
  18. Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1α. Methods in Enzymology. , (2018).
  19. Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, aJ., Eissenberg, J. C. Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila. Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).
  20. Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster. Trends in Genetics. , (2019).
  21. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  22. Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
  23. Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes. Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).
  24. Kolesnikova, T. D., et al. Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene. Fly. 5 (3), Austin. 181-190 (2011).
  25. Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).
  26. Messina, G., et al. Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization. Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).
  27. Aguilar-Fuentes, J., et al. p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model. PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).
  28. Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes. Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).
  29. Farkaš, R., Mechler, B. M. The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response. Cell Death & Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).
  30. Zhang, P., Spradling, A. C. The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin. Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).
  31. Stormo, B. M., Fox, D. T. Polyteny: still a giant player in chromosome research. Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).

Tags

Biologi Drosophila melanogaster heterochromatin spytkirtler kromatine immunostaining HP1a
Immunfluorescerende farvning til visualisering af heterochromatin associerede proteiner i <em>Drosophila</em> Spytkirtler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meyer-Nava, S., Zurita, M.,… More

Meyer-Nava, S., Zurita, M., Valadez-Graham, V. Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands. J. Vis. Exp. (174), e62408, doi:10.3791/62408 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter