الحقن المجهري لنطاط الذرة ، Peregrinus maidis ، الأجنة لتحرير جينوم CRISPR / Cas9
Summary
فيما يلي بروتوكولات لجمع وحقن أجنة نطاط الذرة قبل الخلوية لغرض تعديل الجينوم الخاص بها عن طريق تحرير الجينوم القائم على CRISPR / Cas9 أو لإضافة عناصر قابلة للنقل ملحوظة من خلال تحويل الخط الجرثومي.
Abstract
نطاط نبات الذرة ، Peregrinus maidis ، هو آفة من الذرة وناقل للعديد من فيروسات الذرة. تصف الطرق المنشورة سابقا تحفيز تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) في P. maidis من خلال الحقن المجهري للحمض النووي الريبي المزدوج (dsRNAs) في الحوريات والبالغين. على الرغم من قوة الحمض النووي الريبي ، فإن الأنماط الظاهرية المتولدة عن طريق هذه التقنية عابرة وتفتقر إلى الوراثة المندلية طويلة الأجل. لذلك ، يجب توسيع صندوق أدوات P. maidis ليشمل أدوات جينومية وظيفية من شأنها أن تمكن من إنتاج سلالات متحولة مستقرة ، مما يفتح الباب أمام الباحثين لتقديم طرق مكافحة جديدة للتأثير على هذه الآفة المهمة اقتصاديا. ومع ذلك ، على عكس dsRNAs المستخدمة في RNAi ، فإن المكونات المستخدمة في تحرير الجينوم القائم على CRISPR / Cas9 وتحويل الخط الجرثومي لا تعبر بسهولة أغشية الخلايا. نتيجة لذلك ، يجب حقن الحمض النووي البلازميد و / أو الحمض النووي الريبي و / أو البروتينات في الأجنة قبل أن يتحول الجنين إلى الخلايا ، مما يجعل توقيت الحقن عاملا حاسما للنجاح. وتحقيقا لهذه الغاية ، تم تطوير طريقة وضع البيض القائمة على الأغاروز للسماح بحصاد الأجنة من إناث P. maidis على فترات قصيرة نسبيا. هنا يتم توفير بروتوكولات مفصلة لجمع وحقن أجنة P. maidis قبل الخلوية بمكونات CRISPR (Cas9 nuclease الذي تم تعقيده مع الحمض النووي الريبي التوجيهي) ، ويتم تقديم نتائج الضربة القاضية الجينية المستندة إلى Cas9 لجين P. maidis بلون العين ، أبيض. على الرغم من أن هذه البروتوكولات تصف تحرير جينوم CRISPR / Cas9 في P. maidis ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا لإنتاج P. maidis المعدلة وراثيا عن طريق تحويل الخط الجرثومي ببساطة عن طريق تغيير تكوين محلول الحقن.
Introduction
نطاط نبات الذرة ، Peregrinus maidis ، هو آفة مهمة اقتصاديا للذرة1،2،3. إنها تسبب أضرارا جسدية مباشرة للنبات ، سواء أثناء الرضاعة بأجزاء الفم الماصة للثقب ، وأثناء التكاثر عندما تضع أجنةها مباشرة في الأنسجة النباتية 2,4. على الرغم من الطرق المتعددة للضرر المباشر للمحاصيل ، فإن التأثير الأكبر لهذه الحشرات على صحة المحاصيل غير مباشر ، من خلال العمل كناقل لفيروس موزاييك الذرة (MMV) وفيروس شريط الذرة 5,6. MMV قادر على التكاثر في جسم ناقل P. maidis ، مما يسمح للفيروس بالاستمرار في الحشرات الفردية طوال حياتها ، حتى يتمكنوا من الاستمرار في نشر الفيروس إلى النباتات المضيفة الجديدة 7,8. الطرق الأكثر شيوعا للسيطرة على P. maidis ، وبالتالي الفيروسات التي تنقلها ، هي المبيدات الحشرية.
لسوء الحظ ، تسبب سوء إدارة هذه المنتجات في تطوير المقاومة في الآفة المستهدفة وكذلك تلوث البيئة9. لذلك ، هناك حاجة إلى استراتيجيات جديدة للحد من خسائر المحاصيل من هذا المزيج من الحشرات / الفيروسات والآفات. أظهر العمل السابق أن تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) يمكن أن يكون طريقة تحكم فعالة ل P. maidis لأنها عرضة لخفض التنظيم في التعبير الجيني حتى عند تناول الحمض النووي الريبي المزدوج (dsRNA) 10. ومع ذلك ، فإن الطريقة الأكثر فعالية لإدارة dsRNA في الحقل ستكون من خلال النباتات التي تتغذى عليها الحشرات. وبالتالي ، يمكن أن تظل المحاصيل عرضة لأي فيروسات تحملها الحشرات بالفعل. مع ظهور تحرير جينوم CRISPR / Cas9 ، أصبحت استراتيجيات مكافحة الآفات الجديدة ممكنة ، بما في ذلك محرك الجينات القائم على Cas911,12 ، والذي يمكن استخدامه لتقليل حجم مجموعة الآفات ، أو لاستبدال السكان المذكورين بأفراد مقاومين للفيروسات التي ينقلونها.
ومع ذلك ، فإن تطوير ونشر أي نوع من أنظمة محرك الجينات سيتطلب تطوير تقنيات محورة وراثيا. لم تكن هذه الطرق ضرورية لإجراء تجارب الحمض النووي الريبي في P. maidis لأنه من المفترض أن تكون dsRNAs و / أو siRNAs قادرة على عبور أغشية الخلايا بسبب كفاءة RNAi في P. maidis10،13. هذا لا ينطبق على الحمض النووي و / أو البروتينات المستخدمة في الجينات المحورة التقليدية أو في تحرير الجينات القائمة على Cas9 ، وكلاهما سيكون مقدمة لإنشاء حشرات تحمل محركا جينيا. لإنجاز تحرير الجينات أو أشكال أخرى من التحول الجرثومي ، يتم حقن هذه الحمض النووي والبروتينات بشكل مثالي في الأجنة خلال مرحلة البلاستوديرم المخلوي ، قبل وقت تعدد خلايا جنين الحشرات. التوقيت أمر بالغ الأهمية ، لأن المرحلة المخلوية هي الجزء الأول من التطور14,15. نظرا لأن إناث P. maidis تضع بيضها بشكل تفضيلي في الأنسجة النباتية ، فإن استخراج كميات كافية من الأجنة قبل الخلوية للحقن المجهري يمكن أن يكون كثيف العمالة ويستغرق وقتا طويلا. لذلك ، تم تطوير تقنيات جديدة لجمع أجنة P. maidis وحقنها الدقيق بسرعة قبل الخلوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
جودة وضع البيض والتغذية
في الآونة الأخيرة ، حصل الباحثون الذين يعملون مع نوع ذي صلة ، Nilaparvata lugens ، على البيض الذي استخدموه للحقن المجهري مباشرة من الورقة ، مع الاحتفاظ بالبيض المحقون في أنسجة الأوراق حتى يفقس17. في حين أن هذه الطريقة القائمة على الأوراق وفرت بيئة طبيعية أكثر للتطور الجنيني ، إلا أنها زادت أيضا من فرص الإصابة بالعدوى وتلف البويضات أثناء عملية الإزالة. يوفر نظام وضع البيض الاصطناعي المقدم هنا بيئة أكثر اتساقا ويقلل من فرص تلف البيض من المناولة. من خلال إعداد أكواب وضع البيض يوم الجمعة ، تم جمع غالبية البيض المبيض خلال أسبوع عمل نموذجي ، لصالح أولئك الذين يقومون بأعمال الحقن المجهري. ومع ذلك ، فإن أحد التحذيرات لهذه الطريقة هو أن نقص العناصر الغذائية في النظام الغذائي لمحلول السكروز بنسبة 10٪ سيؤثر في النهاية على صحة الحشرات ، وعادة ما تبدأ الإناث في الكؤوس في الموت بعد 10 أيام فقط. تبدأ جودة البيض أيضا في الانخفاض بعد 6 أيام ، كما يتضح من زيادة البيض الميت أو غير الصحي. نتيجة لذلك ، من المهم أن تكون انتقائيا للبيض المستخدم في الحقن المجهري وعدم الاحتفاظ بالإناث بعد اليوم 6.
معدل البقاء على قيد الحياة والرطوبة
يبدو أن هناك عاملين حاسمين لبقاء الجنين من خلال عملية الحقن المجهري. يتمثل الجانب الأكثر تحديا في التعامل مع أجنة P. maidis في منعها من الجفاف بعد إزالتها من وسط وضع البيض وخلال الحقن المجهري. نظرا لأن البيض يوضع عادة داخل الأنسجة النباتية ، فإنه يفتقر إلى قشرة كافية لمنع الجفاف. حتى في غطاء المحرك المرطب ، فقدت مجموعات كاملة من البيض بسبب الجفاف. ومع ذلك ، يمكن أن تؤثر الرطوبة العالية بشكل مفرط أيضا على الحقن المجهري إذا تراكمت المياه على الشريط على الوجهين أو على النطاق. لسوء الحظ ، لم يكن من السهل عادة ملاحظة جفاف البيض أثناء عملية الحقن المجهري ، وكثيرا ما بدا طبيعيا حتى بعد 2 أو 3 أيام ، عندما أصبحت شفافة تماما ، ولم تظهر أي علامات على التطور.
يبدو أن جودة الإبرة تلعب أيضا دورا مهما في البقاء على قيد الحياة. يجب أن تكون الإبرة مشطوفة لتقليل الأضرار غير الضرورية للبيضة. عندما يتم حظر الإبرة ، فإن استخدام وظيفة المقاصة على الحاقن أثناء ضرب طرف الإبرة برفق باستخدام فرشاة طلاء مبللة (انظر الخطوة 4.7) عادة ما يعيد الإبرة إلى حالة وظيفية. بغض النظر ، يوصى بوضع كميات صغيرة فقط من محلول الحقن (~ 0.25 ميكرولتر) في كل إبرة والتحول إلى إبرة جديدة كل بضع شرائح (~ 50-60 بيضة) لضمان الحفاظ على جودة الإبرة طوال عملية الحقن.
جيل ناجح من النمط الظاهري بالضربة القاضية
لتحويل الخلايا الجرثومية بنجاح ، يجب إجراء الحقن المجهري للأجنة في أقرب وقت ممكن قبل الخلوي. اعتمادا على أنواع الحشرات ، تتراوح النافذة الزمنية لإكمال الحقن المجهري من ساعتين فقط إلى ما يصل إلى يوم كامل14،15،20. لا يزال من غير الواضح متى تخضع أجنة P. maidis لعملية خلوية. تم اختبار الضربة القاضية بوساطة Cas9 على أجنة لا تتجاوز 4 ساعات بعد وضع البويضة (pel) إلى ما يصل إلى 16 ساعة pel ، ولوحظت الأنماط الظاهرية المتوقعة في جميع التجارب ، مما يشير إلى أن جميع الحقن المجهري تم إجراؤها داخل نافذة ما قبل التخليق.
تم اختيار تقويم P. maidis لجين لون العين ، الأبيض ، لأنه كان من المتوقع أن يكون النمط الظاهري بالضربة القاضية سهل الفحص في الحقن بسبب طبيعته المستقلة للخلية. في الواقع ، كما هو متوقع ، كان من الممكن تحديد كل من الفسيفساء والضربة القاضية الكلية بوضوح بين الأجنة التي تتلقى خليط الحقن الذي يحتوي على Cas9 وتوجيه الحمض النووي الريبي. لسوء الحظ ، لم يفقس أي حقن بالضربة القاضية الكاملة ، وفشل التزاوج الجماعي للحقن الباقين على قيد الحياة في توليد ذرية بيضاء العينين. ومع ذلك ، تم إنشاء خط متحور بنجاح في وقت لاحق من خلال استهداف جين مختلف (Klobasa et al. ، قيد التقدم). قد يشير هذا إلى أن الفشل في إنشاء خط متحور أبيض يرجع على الأرجح إما إلى تأثيرات خارج الهدف (أي قطع Cas9 مناطق مهمة في أماكن أخرى من الجينوم) مما يولد طفرة قاتلة مرتبطة ارتباطا وثيقا ، أو إلى دور حرج غير متوقع للبيض في P. maidis.
تؤكد بيانات النمط الظاهري والجزيئي (الشكل 8 والشكل 9) أنه تم إنشاء ضربة قاضية كبيرة في الموضع الأبيض في عينة من الأجنة المحقونة ، مما قد يؤدي إلى فقدان كامل لوظيفة الجينات. علاوة على ذلك ، في حين أن الطفرات في اللون الأبيض قابلة للحياة في بعض الأنواع ، إلا أن هناك سابقة لانخفاض النشاط الأبيض ضارا21,22. ومع ذلك ، لا يمكن استبعاد التأثيرات خارج الهدف تماما. يتطلب التنبؤ بالأهداف المحتملة خارج الأهداف بيانات دقيقة لتسلسل الجينوم23 ، وهو ما يجعل الوضع الحالي للموارد الجينومية في P. maidis من المستحيل القيام به في هذا الوقت. بغض النظر ، مع هذه الأساليب الجديدة ، يمكن إجراء اختبار الجينات المستهدفة الأخرى بثقة ، حتى التحرك نحو المزيد من الجينات المحورة التقليدية في محاولة لجلب أدوات وراثية جديدة لهذه الآفة الخبيثة.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
جامعة ولاية كارولينا الشمالية ، قسم علم الحشرات وأمراض النبات ، هي جزء من فريق يدعم برنامج حلفاء الحشرات التابع ل DARPA. وجهات النظر والآراء و / أو النتائج المعبر عنها هي آراء المؤلفين ولا ينبغي تفسيرها على أنها تمثل وجهات النظر أو السياسات الرسمية لوزارة الدفاع أو حكومة الولايات المتحدة. يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة. صممت MDL و DR و AEW المشروع وقدمت الحصول على التمويل وإدارة المشروع والموارد. قامت FC و WK و NG و MDL بتصميم وتصميم تجارب الحقن المجهري. OH تصور وتصميم طريقة وضع البيض. أجرى FC و WK التجارب. قام FC و WK بتحليل النتائج. وكتب FC و WK و NG و MDL المخطوطة. يود المؤلفون تقديم شكر خاص لكايل سوزانسكي وفيكتوريا بارنيت لمساعدتهما في الحفاظ على مستعمرات P. maidis.
Materials
| 1 oz Containers | Dart | P100N | Adult container for egg-laying setup |
| 15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-103 | Serves as collection tube on vacuum aspirator setup |
| 15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-106 | For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening |
| Aspirator | Bioquip | 1135A | For handling planthoppers |
| Vacuum Aspirator | Fischer Technical | LAV-3 | Vacuum for aspirating larger numbers of insects |
| Blue Spectrum LED Lights | Home Depot | GLP24FS/19W/LED | Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on |
| Cas9 | TrueCut Cas9 Protein v2 | A36498 | Endonuclease for cutting planthopper genes |
| Clear Vinyl Tubing | Home Depot | 3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft. | Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup |
| Corn planthoppers | North Carolina State University | N/A | Request from Dr. Anna Whitfield's lab |
| Cotton balls | Genessee | 51-101 | Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup |
| Double sided tape | Scotch Double Sided Tape | NA | Holding eggs for microinjection |
| Early Sunglow corn | Park Seed Company | 05093-PK-N | Corn for rearing planthoppers |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Femtojet Microinjection System | Eppendorf | 5247 | Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size) |
| Nutri-Fly Drosophila Agar | Genessee | 66-103 | Substrate for everything except egg-laying dish |
| Fine forceps | Bioquip | 4731 | Egg handling |
| General Purpose LE Agarose | Apex | 20-102 | Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium) |
| Guide RNA 1 – GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
| Guide RNA 2 – UCUGAAAUCACUGGCCAAUA | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
| Guide RNA 3 – GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
| Humidifyer | Homedics | UHE-CM45 | For providing humidity in humidified hood |
| Humidity chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | For holding injected embryos until hatching |
| Insect rearing cages | Bioquip (special order) | Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides) | Cage for planthoppers on corn |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160 |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | Planthopper screening |
| Microinjection Scope | Leica | MZ12-5 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | For positioning microinjection needle |
| Micropipette beveler | Sutter Instruments | FG-BV10-D | For beveling injection needles / Used 'fine' graded plate at 20° angle |
| Microscope Stage | AmScope | GT100 X-Y Gliding Table | For positioning and moving embryos under microscope |
| Miniature Paint Brush | Testor #2 8733 | Sold in 3 pack 281206 | Fine paintbrushes for embryo handling |
| Needle Holder | Narishige | HI-7 | For holding the microinjection needle |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | Rearing injectees until hatch |
| Petri Dishes (100 x 15 mm) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay |
| pGEM-T Easy Vector System I cloning kit | Promega | A1360 | Cloning Pm white target site |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Plain Microscope Slides or coverslip | Fisher Scientific | 12-549-3 | Hold eggs for microinjection |
| Plasmid DNA Midi Kit | Zymo | D4200 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Roll size 4 in. x 125 ft |
| Plastic wrap | Glad ClingWrap Plastic Wrap | NA | Wrap the entire egg-laying chamber |
| Primer – PmW CRISPR check F1 – AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Primer – PmW CRISPR check R1 – GATTCCTCGCTGTTGGGT | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Primer – PmW CRISPR check F3 – TCACAGACCCTGGTGCTAATC | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Primer – PmW CRISPR check R3 – GTCCACAATCCACACTTCTGA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Quartz capillaries | Sutter Instruments | QF100-50-10 | For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length |
| Screen (White Organza Fabric) | Joann Fabrics | 16023889 | For covering the adult container |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | To make 10% sucorose solution |
Referencias
- Namba, R., Higa, S. Y. Host plant studies of the corn planthopper, Peregrinus maidis (Ashmead) in Hawaii. Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 21, 105-108 (1971).
- Singh, B. U., Seetharama, N. Host plant interactions of the corn planthopper, Peregrinus maidis Ashm.(Homoptera: Delphacidae) in maize and sorghum agroecosystems. Arthropod-Plant Interactions. 2 (3), 163-196 (2008).
- Tsai, J. Occurrence of a corn disease in Florida transmitted by Peregrinus maidis. Plant Disease Reporter. 59 (10), 830-833 (1975).
- Chelliah, S., Basheer, M. Biological studies of Peregrinus maidis (Ashmead) (Araeopidae: Homoptera) on sorghum. Indian Journal of Entomology. 27, 466-471 (1965).
- Lastra, J., Esparza, J. Multiplication of vesicular stomatitis virus in the leafhopper Peregrinus maidis (Ashm.), a vector of a plant rhabdovirus. Journal of General Virology. 32 (1), 139-142 (1976).
- Nault, L. R., Ammar, E. -. D. Leafhopper and planthopper transmission of plant viruses. Annual Review of Entomology. 34 (1), 503-529 (1989).
- Ammar, E. -. D., Tsai, C. -. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts. Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).
- Barandoc-Alviar, K., Ramirez, G. M., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. Analysis of acquisition and titer of Maize mosaic rhabdovirus in its vector, Peregrinus maidis (Hemiptera: Delphacidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 14 (2016).
- Tsai, J. H., Steinberg, B., Falk, B. W. Effectiveness and residual effects of seven insecticides on Dalbulus maidis (Homoptera: Cicadellidae) and Peregrinus maidis (Homoptera: Delphacidae). Journal of Entomological Science. 25 (1), 106-111 (1990).
- Yao, J., Rotenberg, D., Afsharifar, A., Barandoc-Alviar, K., Whitfield, A. E. Development of RNAi methods for Peregrinus maidis, the corn planthopper. PloS One. 8 (8), 70243 (2013).
- Esvelt, K. M., Smidler, A. L., Catteruccia, F., Church, G. M. Emerging technology: concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations. Elife. 3, 03401 (2014).
- Gantz, V. M., Bier, E. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
- Yao, J., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. Delivery of maize mosaic virus to planthopper vectors by microinjection increases infection efficiency and facilitates functional genomics experiments in the vector. Journal of Virological Methods. 270, 153-162 (2019).
- Kimelman, D., Martin, B. L. Anterior-posterior patterning in early development: three strategies. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (2), 253-266 (2012).
- Mito, T., Nakamura, T., Noji, S. Evolution of insect development: to the hemimetabolous paradigm. Current Opinion in Genetics & Development. 20 (4), 355-361 (2010).
- Grubbs, N., Haas, S., Beeman, R. W., Lorenzen, M. D. The ABCs of eye color in Tribolium castaneum: orthologs of the Drosophila white, scarlet, and brown Genes. Genética. 199 (3), 749-759 (2015).
- Xue, W. H., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of two eye pigmentation genes in the brown planthopper, Nilaparvata lugens (Hemiptera: Delphacidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 93, 19-26 (2018).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3998 (2012).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94 (3), 441-448 (1975).
- Chu, F. C., Wu, P. S., Pinzi, S., Grubbs, N., Lorenzen, M. D. Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or CRISPR/Cas9 genome editing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57497 (2018).
- Brent, C. S., Hull, J. J. RNA interference-mediated knockdown of eye coloration genes in the western tarnished plant bug (Lygus hesperus Knight). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 100 (2), 21527 (2019).
- Khan, S. A., Reichelt, M., Heckel, D. G. Functional analysis of the ABCs of eye color in Helicoverpa armigera with CRISPR/Cas9-induced mutations. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Manghwar, H., et al. CRISPR/Cas systems in genome editing: methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects. Advanced Science. 7 (6), 1902312 (2020).
