Generazione di organoidi polmonari interi 3D da cellule staminali pluripotenti indotte per la modellazione della biologia e della malattia dello sviluppo polmonare
Summary
L’articolo descrive la differenziazione diretta graduale delle cellule staminali pluripotenti indotte in organoidi polmonari interi tridimensionali contenenti cellule polmonari epiteliali sia prossimali che distali insieme a mesenchima.
Abstract
Lo sviluppo e la malattia polmonare umana sono stati difficili da studiare a causa della mancanza di sistemi modello in vitro biologicamente rilevanti. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPSC) possono essere differenziate gradualmente in organoidi polmonari multicellulari 3D, costituiti da popolazioni di cellule epiteliali e mesenchimali. Ricapitoliamo i segnali di sviluppo embrionale introducendo temporalmente una varietà di fattori di crescita e piccole molecole per generare in modo efficiente l’endoderma definitivo, l’endoderma dell’intestino anteriore e successivamente le cellule progenitrici polmonari. Queste cellule vengono quindi incorporate nel mezzo della matrice della membrana basale a fattore di crescita ridotto (GFR), consentendo loro di svilupparsi spontaneamente in organoidi polmonari 3D in risposta a fattori di crescita esterni. Questi organoidi polmonari interi (WLO) subiscono fasi iniziali di sviluppo polmonare tra cui morfogenesi ramificata e maturazione dopo l’esposizione a desametasone, AMP ciclico e isobutilxantina. I WLO possiedono cellule epiteliali delle vie aeree che esprimono i marcatori KRT5 (basale), SCGB3A2 (club) e MUC5AC (calice) e cellule epiteliali alveolari che esprimono HOPX (tipo alveolare I) e SP-C (tipo alveolare II). Sono presenti anche cellule mesenchimali, tra cui l’actina della muscolatura liscia (SMA) e il recettore A del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα). I WLO derivati da iPSC possono essere mantenuti in condizioni di coltura 3D per molti mesi e possono essere ordinati per i marcatori di superficie per purificare una specifica popolazione cellulare. I LLO derivati da iPSC possono anche essere utilizzati per studiare lo sviluppo polmonare umano, compresa la segnalazione tra l’epitelio polmonare e il mesenchima, per modellare mutazioni genetiche sulla funzione e lo sviluppo delle cellule polmonari umane e per determinare la citotossicità degli agenti infettivi.
Introduction
Il polmone è un organo complicato, eterogeneo e dinamico che si sviluppa in sei fasi distinte: maturazione embrionale, pseudoghiandolare, canalicolare, sacculare, alveolare e microvascolare1,2. Le ultime due fasi si verificano prima e dopo la nascita nello sviluppo umano, mentre le prime quattro fasi si verificano esclusivamente durante lo sviluppo fetale, a meno che non si verifichi la nascita pretermine3. La fase embrionale inizia nello strato germinale endodermico e si conclude con il germogliamento della trachea e delle gemme polmonari. Lo sviluppo polmonare avviene in parte attraverso la segnalazione tra le cellule epiteliali e mesenchimali4. Queste interazioni provocano la ramificazione polmonare, la proliferazione, la determinazione del destino cellulare e la differenziazione cellulare del polmone in via di sviluppo. Il polmone è diviso in zone conduttrici (trachea ai bronchioli terminali) e zone respiratorie (bronchioli respiratori agli alveoli). Ogni zona contiene tipi di cellule epiteliali uniche; comprese le cellule basali, secretorie, ciliate, a pennello, neuroendocrine e ionocitarie nelle vie aeree conduttrici5, seguite da cellule alveolari di tipo I e II nell’epitelio respiratorio6. Molto è ancora sconosciuto sullo sviluppo e la risposta alle lesioni dei vari tipi di cellule. I modelli di organoidi polmonari derivati da iPSC consentono lo studio dei meccanismi che guidano lo sviluppo del polmone umano, gli effetti delle mutazioni genetiche sulla funzione polmonare e la risposta sia dell’epitelio che del mesenchima agli agenti infettivi senza la necessità di tessuto polmonare umano primario.
I marcatori corrispondenti ai vari stadi della differenziazione embrionale includono CXCR4, cKit, FOXA2 e SOX17 per l’endoderma definitivo (DE)7, FOXA2, TBX1 e SOX2 per l’endoderma anteriore dell’intestino anteriore (AFE)8 e NKX2-1 per le prime cellule progenitrici polmonari9. Nello sviluppo polmonare embrionale, l’intestino anteriore si divide nell’esofago dorsale e nella trachea ventrale. Le gemme dei polmoni destro e sinistro appaiono come due outpouching indipendenti attorno al germoglio tracheale10. Durante la morfogenesi ramificata, il mesenchima che circonda l’epitelio produce tessuto elastico, muscolatura liscia, cartilagine e vascolarizzazione11. L’interazione tra l’epitelio e il mesenchima è essenziale per il normale sviluppo polmonare. Ciò include la secrezione di FGF1012 da parte del mesenchima e SHH13 prodotto dall’epitelio.
Qui, descriviamo un protocollo per la differenziazione diretta delle hiPSC in organoidi polmonari interi tridimensionali (3D) (WLO). Mentre ci sono approcci simili che incorporano l’isolamento delle cellule progenitrici polmonari tramite smistamento allo stadio LPC per produrre organoidi alveolari14,15 (distali) o organoidi delle vie aeree16 (prossimali), o generare sferoidi ventrali-anteriori del foregut per produrre organoidi polmonari umani che esprimono marcatori alveolari e mesenchimali e organoidi progenitori della punta delle gemme17 , il punto di forza di questo metodo è l’inclusione di entrambi i tipi di cellule epiteliali e mesenchimali polmonari per modellare e orchestrare la morfogenesi, la maturazione e l’espansione della ramificazione polmonare in vitro.
Questo protocollo utilizza piccole molecole e fattori di crescita per dirigere la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti attraverso l’endoderma definitivo, l’endoderma dell’intestino anteriore e le cellule progenitrici polmonari. Queste cellule vengono quindi indotte in organoidi polmonari interi 3D attraverso importanti fasi di sviluppo, tra cui la ramificazione e la maturazione. Il riassunto del protocollo di differenziazione è mostrato nella Figura 1a con immagini rappresentative in campo luminoso della differenziazione endodermica e organoide mostrata nella Figura 1b. La Figura 1c,d mostra i dettagli dell’espressione genica della differenziazione endodermica e l’espressione genica di entrambe le popolazioni prossimali e distali delle cellule epiteliali polmonari dopo aver completato la differenziazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il successo della differenziazione degli organoidi polmonari interi 3D (WLO) si basa su un protocollo multi-step di 6 settimane con attenzione ai dettagli, incluso il tempo di esposizione a fattori di crescita e piccole molecole, la densità cellulare dopo il passaggio e la qualità delle hiPSC. Per la risoluzione dei problemi, vedere la Tabella 2. Le hiPSC dovrebbero essere confluenti per circa il 70%-80%, con meno del 5% di differenziazione spontanea prima della dissociazione. Questo protocollo richied…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata dal California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
Referencias
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