Détection de l’anticorps du domaine de liaison au récepteur du SARS-CoV-2 à l’aide d’un biorapporteur basé sur HiBiT

Summary

Le protocole décrit la procédure de production du complexe protéique du domaine de liaison au récepteur HiBiT et son application pour la détection rapide et sensible des anticorps anti-SARS-CoV-2.

Abstract

L’émergence de la pandémie de COVID-19 a accru le besoin de meilleures méthodes de détection sérologique pour déterminer l’impact épidémiologique du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2). Le nombre croissant d’infections par le SRAS-CoV-2 soulève la nécessité de meilleurs tests de détection des anticorps. Les méthodes actuelles de détection des anticorps compromettent la sensibilité pour la vitesse ou sont sensibles mais prennent beaucoup de temps. Une grande partie des anticorps neutralisant le SRAS-CoV-2 ciblent le domaine de liaison aux récepteurs (RBD), l’un des principaux compartiments immunogènes du SARS-CoV-2. Nous avons récemment conçu et développé un RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) hautement sensible et marqué au bioluminescent pour détecter les anticorps du SRAS-CoV-2. Le texte suivant décrit la procédure à suivre pour produire le complexe HiBiT-RBD et un test rapide pour évaluer la présence d’anticorps ciblant rbD à l’aide de cet outil. En raison de la durabilité du produit protéique HiBiT-RBD sur une large plage de températures et de la procédure expérimentale plus courte qui peut être achevée en 1 h, le protocole peut être considéré comme une alternative plus efficace pour détecter les anticorps du SRAS-CoV-2 dans les échantillons de sérum des patients.

Introduction

L’émergence récente d’un nouveau coronavirus, le SRAS-CoV21, a causé plus de 2 800 000 décès et 128 millions d’infections au ^{30 mars} 20212. En raison de l’absence d’une procédure de traitement fiable et bien établie pour les thérapies cliniques du SRAS-CoV-2, de nombreux efforts ont été déployés pour limiter la transmission virale et, plus important encore, pour développer un traitement efficace et robuste ou un ^vaccin3. À ce jour, plus de 50 candidats vaccins contre la COVID-19 font l’objet d’essais rapportés par l’Organisation mondiale de la ^Santé4. La détection d’anticorps contre le SARS-CoV-2 est d’une importance capitale pour déterminer la stabilité à long terme de la réponse humorale lors de l’administration du vaccin ainsi que chez les patients guéris de la COVID-195. Certaines études ont démontré qu’il est possible que les patients guéris du SRAS-CoV-2 perdent la plupart des anticorps de liaison à la RBD après 1 ^an5,6,7,8,9. Des recherches plus approfondies sont nécessaires pour mieux comprendre l’immunité durable, et des plates-formes de détection d’anticorps plus sensibles peuvent aider à poursuivre ces travaux. Les rapports sur l’immunité soutenue des infections légères par le SRAS-CoV-2, qui suggèrent des réponses anticorps à long terme, constituent également un domaine d’étude intéressant et utile. Une méthode de détection rapide et précise est essentielle pour surveiller les anticorps dans le sérum des individus afin de fournir plus d’informations sur l’immunité dans la population.

Comme d’autres coronavirus, le SARS-CoV-2 utilise la glycoprotéine de pointe saillante pour se lier à l’enzyme de conversion de l’angiotensine-2 (ACE2) afin d’initier une cascade d’événements qui conduisent à la fusion des membranes virale et ^{cellulaire6,7}. Plusieurs études ont récemment prouvé que la RBD de la protéine Spike joue un rôle crucial dans l’obtention d’une réponse anticorps puissante et spécifique contre le SARS-CoV28,9,10,11. En particulier, les corrélations observées par Premkumar et coll. entre le titre d’anticorps liant la RBD et la puissance de neutralisation du plasma des patients par le SRAS-CoV-2 sont compatibles avec le fait que la RBD est un compartiment immunogène de la structure du ^virus9. Dans cet esprit, de nombreux tests diagnostiques disponibles pour la détection des anticorps sars-CoV-2 sont longs et coûteux, nécessitent une longue procédure d’incubation et de lavage (test immuno-enzymatique [ELISA]), ou manquent de sensibilité et de précision (test immunologique à flux latéral [LFIA])¹². Par conséquent, une méthode sérologique complémentaire quantitative et rapide de détection des anticorps dérivés de la COVID-19 avec une sensibilité élevée, une réponse rapide et un coût relativement faible répondrait au besoin d’un test sérologique fiable pour la surveillance épidémiologique du SRAS-CoV-2.

Collectivement, les limites des essais sérologiques actuels ont incité à étudier le système de déclaration bioluminescente en tant qu’agent de diagnostic potentiel dans les futures enquêtes sérologiques. La bioluminescence est une réaction enzyme/substrat naturelle, avec émission de lumière. La nanoluc luciférase est la plus petite (19 kDa), mais le système le plus brillant par rapport à Renilla et à la luciole luciférase (36 kDa et 61 kDa, respectivement)^13,14. En outre, Nanoluc a le rapport signal / bruit le plus élevé et la stabilité parmi les systèmes mentionnés précédemment. L’intensité de signal élevée de Nanoluc prend en charge la détection de très faibles quantités de fusions ^{rapporteures15}. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) est une version divisée du système Nanoluc, qui est composé de deux segments: petit BiT (11 acides aminés; SmBiT) et grand BiT (LgBiT) avec des interactions d’affinité relativement faible (_KD = 190 μM) pour former un complexe ^{luminescent16}. NanoBiT est largement utilisé dans diverses études impliquant l’identification des interactions protéine-protéine15,17,18,19 et des voies de signalisation ^{cellulaire11,20,21}.

Récemment, un autre petit peptide avec une affinité nettement plus élevée pour LgBiT (_KD = 0,7 nM) a été introduit, à savoir le système HiBiT Nano-Glo, à la place de SmBiT. La haute affinité et le signal fort du test Nano-Glo « add-mix-read » font de HiBiT une étiquette peptidique luminescente quantitative appropriée. Dans cette approche, la balise HiBiT est ajoutée à la protéine cible en développant une construction imposant une interférence structurelle minimale. La fusion de la protéine HiBiT se lierait activement à la contrepartie LgBiT, produisant une enzyme luciférase hautement active pour générer une bioluminescence détectable en présence de réactifs de détection (Figure 1). De même, nous avons développé un système basé sur HiBiT Nano-Glo pour mesurer facilement le titre d’anticorps neutralisants dans le sérum des individus guéris du SRAS-CoV-2 et avons récemment développé un RBD SARS-CoV-2 marqué HiBiT. Cet article décrit le protocole de production du biorapporteur HiBiT-RBD à l’aide de procédures et d’équipements de laboratoire standard, et montre comment ce biorapporteur peut être utilisé dans un test rapide et efficace pour détecter les anticorps ciblant le SARS-CoV-2 RBD.

Protocol

REMARQUE: Le protocole décrit ci-dessous adhère à toutes les directives d’éthique conformément au code de protocole 20200371-01H. 1. Production et évaluation du bioreporter HiBiT-RBD Produire une quantité suffisante de bioreporter HiBiT-RBD Se préparer à la culture cellulaire Préparer le milieu Eagle modifié (DMEM) complet de Dulbecco contenant 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline/streptomycine. Ensuite, réchauffez le média dans un bain-ma…

Representative Results

Les signaux provenant à la fois du lysat cellulaire contenant du HiBit-RBD et du surnageant des cellules transfectées ont été enregistrés (Figure 2) pour évaluer la source de protéines appropriée. HiBiT-RBD et LgBit ont été utilisés séparément comme contrôles, et les données ont montré un faible arrière-plan par rapport à un signal fort lorsque les deux parties ont été combinées. Par conséquent, l’interaction HiBiT-RBD avec LgBiT est nécessaire pour générer une enz…

Discussion

Le nombre croissant de personnes infectées par le SARS-CoV-2 et les efforts continus pour la vaccination mondiale nécessitent des tests sérologiques sensibles et rapides qui peuvent être utilisés dans les enquêtes sérologiques à grande échelle. Des recherches récentes montrent que les biorapporteurs à base de nanoluciférase fractionnée peuvent être utilisés pour développer de tels tests. Nous avons récemment développé le biorapporteur HiBiT-RBD pour concevoir un test qui peut être utilisé pour détec…

Materials

5x Passive Lysis Buffer	Promega	E194A	30 mL
Bio-Plex Handheld Magnetic Washer	Bio-Rad	171020100
DMEM	Sigma	D6429-500ml
Dual-Glo luciferase Assay System	Promega	E2940	100 mL kit
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F1051
HiBiT-RBD Plasmid			gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA 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LgBiT	Promega	N3030
penicillin Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Pierce Protein G Magnetic Beads	Thermo Fisher Scientific	88848
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent	Signagen	SL100688.5
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab	SinoBiological	40592-MM57
Synergy Mx Microplate Reader	BioTek		96-well plate reader luminometer
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	2520056	0.25%