Summary
Qui è descritto un metodo consolidato per determinare l'entità della restrizione dell'HIV-1 da parte della proteina inibitoria cellulare SAMHD1. Le cellule U937 della linea mieloide umana sono trasdotte con un vettore di espressione SAMHD1 che co-esprime YFP, differenziate e quindi sfidate con HIV-RFP. Il livello di restrizione è determinato dall'analisi della citometria a flusso.
Abstract
La proteina 1 sterile contenente dominio α-motivo/istidina-aspartato (SAMHD1) inibisce la replicazione dell'HIV-1 nelle cellule mieloidi quiescenti. Le cellule U937 sono ampiamente utilizzate come sistema cellulare conveniente per analizzare l'attività di SAMHD1 a causa di un basso livello di espressione dell'RNA SAMHD1, che porta a un'espressione proteica endogena non rilevabile. Sulla base di saggi simili sviluppati nel laboratorio Stoye per caratterizzare altri fattori di restrizione retrovirale, il laboratorio Bishop ha sviluppato un saggio di restrizione a due colori per analizzare SAMHD1 nelle cellule U937. Leucemia murina Le particelle simili al virus che esprimono SAMHD1, insieme a YFP espresso da un IRES, sono utilizzate per trasdurre le cellule U937. Le cellule vengono quindi trattate con phorbol miristato acetato per indurre la differenziazione in un fenotipo quiescente. Dopo la differenziazione, le cellule vengono infettate con particelle simili al virus HIV-1 che esprimono un reporter fluorescente. Dopo 48 ore, le cellule vengono raccolte e analizzate mediante citometria a flusso. La percentuale di cellule infette da HIV nella popolazione che esprime SAMHD1 è confrontata con quella nelle cellule di controllo interno prive di SAMHD1. Questo confronto rivela un rapporto di restrizione. L'espressione di SAMHD1 porta a una riduzione di cinque volte dell'infezione da HIV, corrispondente a un rapporto di restrizione di 0,2. La nostra recente sostituzione della RFP con la GFP originale come gene reporter per l'infezione da HIV ha facilitato l'analisi della citometria a flusso.
Questo test è stato utilizzato con successo per caratterizzare l'effetto delle sostituzioni aminoacidiche sulla restrizione di SAMHD1 trasducendo con virus che codificano proteine SAMHD1 alterate, derivate dalla mutagenesi sito-diretta del vettore di espressione. Ad esempio, le sostituzioni catalitiche del sito HD206-7AA mostrano un fenotipo di restrizione di 1, indicando una perdita di attività di restrizione. Allo stesso modo, è possibile determinare la suscettibilità di diversi virus tester. Il test può essere ulteriormente adattato per incorporare l'effetto dello stato di differenziazione, dello stato metabolico e dei modificatori SAMHD1 per comprendere meglio la relazione tra SAMHD1, stato metabolico cellulare e restrizione virale.
Introduction
La proteina 1 sterile contenente il dominio α-motivo/istidina-aspartato (SAMHD1) impedisce la replicazione del virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) nelle cellule quiescenti della linea mieloide. SAMHD1 blocca la replicazione attraverso la sua attività enzimatica come una trifosfoidrolasi dNTP, che si traduce in una diminuzione dei livelli di dNTP intracellulari. Di conseguenza, l'HIV-1 non può eseguire il processo di trascrizione inversa in modo efficiente. Molti progressi sono stati fatti nei pochi anni successivi a questa osservazione iniziale, in particolare per quanto riguarda il contributo di domini specifici e aminoacidi all'attività antivirale di SAMHD1. Queste intuizioni sono state fatte utilizzando saggi biochimici e sistemi cellulari che imitano l'ambiente mieloide quiescente fisiologicamente rilevante. Le cellule U9371 sono ampiamente utilizzate come un comodo sistema di cellule mieloidi per analizzare l'attività di SAMHD1. Ciò è dovuto alla mancanza di espressione endogena di SAMHD1, che si pensa sia dovuta a bassi livelli di RNA rispetto alle cellule che esprimono SAMHD1 (un'area di ricerca in corso). Qui, il protocollo descrive la trasduzione transitoria di cellule U937 con particelle simili a virus che co-esprimono SAMHD1 e un reporter di proteina fluorescente gialla (YFP) per esaminare il meccanismo di restrizione SAMHD1 dell'HIV-1. Tali saggi transitori di citometria a flusso a due colori per esaminare le restrizioni retrovirali sono stati sviluppati per la prima volta nel laboratorio Stoye2 e da allora sono stati adattati per studiare altri fattori di restrizione, tra cui le proteine del motivo tripartito (TRIM)3. Ispirato da questi test, il laboratorio Bishop ha sviluppato un test a due colori per analizzare la restrizione SAMHD1 nelle cellule U937.
Il flusso di lavoro per l'esperimento è illustrato nella Figura 1. Le particelle simili al virus della leucemia murina (MLV) contenenti un messaggio bi-cistronico che codifica SAMHD1 insieme a YFP espresso da un IRES sono utilizzate per trasdurre le cellule U937. Le cellule vengono quindi trattate con phorbol miristate acetato (PMA) per indurre la differenziazione a un fenotipo quiescente. Le cellule sono successivamente infettate da particelle simili al virus HIV-1 che esprimono la proteina fluorescente rossa (RFP). Dopo 48 ore, le cellule vengono raccolte e analizzate mediante citometria a flusso bicolore. Questo test viene utilizzato anche con YFP e proteina fluorescente verde (GFP), che richiedono combinazioni di filtri meno standard per l'analisi della citometria a flusso. L'uso di HIV-RFP consente una compensazione più semplice e quindi il test è più facilmente accessibile agli utenti di citometria a flusso meno esperti e realizzabile con la maggior parte dei citometri.
Durante l'analisi, la proporzione di cellule infette da HIV viene confrontata tra le cellule che esprimono SAMHD1 e quelle prive di SAMHD1 all'interno dello stesso pozzetto di cellule. Ciò consente un controllo interno nel tubo di citometria pozzo / flusso, che è una caratteristica chiave. Il confronto dei livelli di infezione nelle cellule trasdotte e non trasdotte rivela un rapporto di restrizione. Un rapporto di 1,0 indica che il fattore trasdotto non ha alcun effetto sull'infettività. L'espressione di SAMHD1 di tipo selvatico porta a una riduzione di cinque volte dell'infezione da HIV in questo test, corrispondente a un rapporto di restrizione di 0,2. Mentre questo effetto è modesto rispetto ai fattori di restrizione più classici come TRIM5, l'effetto è comunque riproducibile e consente la classificazione degli espressivi SAMHD1 modificati in quelli che si limitano in modo equivalente alla proteina wild-type, quelli che non riescono a limitare e quelli con un fenotipo intermedio.
Questo test è stato utilizzato con successo per caratterizzare i fenotipi di restrizione del dominio SAMHD1 e dei mutanti degli aminoacidi trasducendo con virus che codificano sequenze SAMHD1 mutanti. Ad esempio, le sostituzioni del sito catalitico HD206-7AA non riescono a limitare in questo test. Allo stesso modo, è possibile determinare la suscettibilità di diversi virus tester. Ad esempio, i mutanti della trascrittasi inversa dell'HIV-1 sono più suscettibili alla restrizione mediata da SAMHD1 (ad esempio, 151V4). Questo protocollo delinea i dettagli della produzione di particelle virus-simili (VLP), la trasduzione di U937 con vettori di espressione SAMHD1, l'infezione da HIV che trasporta un reporter fluorescente e la successiva analisi mediante citometria a flusso. In questo articolo vengono illustrati quali dati aspettarsi e come evitare risultati non ottimali. Infine, vengono delineati usi alternativi per il test, oltre ad esaminare diverse varianti di SAMHD1 per comprendere più a fondo l'interazione tra SAMHD1, livelli di dNTP e infezione virale. Dato il ruolo di SAMHD1 al centro del metabolismo cellulare, con ulteriori collegamenti al cancro, questa continua ad essere un'area di intenso interesse.
Protocol
Questo protocollo non contiene studi che coinvolgono animali o partecipanti umani eseguiti da nessuno degli autori. Tutte le fasi di questo protocollo sono state eseguite seguendo le linee guida e i codici di condotta delle istituzioni in cui sono state effettuate.
1. Trasfezione di cellule 293T per la produzione di VLP (sia vettori di espressione di SAMHD1 che particelle HIV tester)
NOTA: I contributi più significativi al successo della produzione di particelle virali sono la salute delle cellule 293T produttrici, la confluenza alla trasfezione e il momento del raccolto. I laboratori avranno in genere i loro reagenti di trasfezione preferiti e il protocollo per la produzione di particelle retrovirali. Il seguente protocollo produce particelle infettive di buona qualità, ma protocolli equivalenti sarebbero adatti anche per questa applicazione. Per mantenere una buona qualità delle cellule 293T, passare almeno tre volte alla settimana per mantenere un tasso di crescita costante. Le cellule dovrebbero essere seminate nella fase di log della crescita per una trasfezione efficiente.
- Giorno 1: seminare il numero richiesto di piatti da 10 cm con una divisione di 1/4 da un piatto quasi confluente di 293T cellule per ottenere circa il 60% di confluenza il giorno seguente (circa 5 x 105 cellule / ml). Potrebbe essere necessario seminare diverse densità per ottenere una densità appropriata per la trasfezione il giorno seguente quando si lavora con un nuovo stock cellulare.
- Giorno 2 (mattina): Verificare la presenza di circa il 60% di confluenza al microscopio e sostituire delicatamente i mezzi sulle cellule con 10 ml di Modified Eagle Medium (DMEM) fresco di Dulbecco.
- Giorno 2 (pomeriggio, almeno 4 ore dopo il cambio del supporto): Transfetto per la produzione VLP.
- Costituire la miscela di diluizione del DNA contenente 3 μg ciascuno di plasmide espressivo gag-pol , plasmide reporter guidato da ripetizione terminale (LTR) e plasmide espressivo della proteina G del virus della stomatite vescicolare (VSV-G) (totale 9 μg, vedere NOTA) in 600 μL di DMEM privo di siero. Vortice e centrifugare brevemente (15 s, >500 x g).
- Aggiungere 20 μL di reagente di trasfezione (vedere Tabella dei materiali), vortice (non centrifugare) e incubare a 20 °C per 15-20 minuti. Aggiungere la miscela di trasfezione a goccia sulla piastra, ruotare delicatamente per mescolare e tornare all'incubatore.
NOTA: Per MLV VLP che esprime SAMHD1 utilizzare KB4 5,6 (plasmide espressivo gag-pol), pLGatewaySAMHD1IeYFP1 (plasmide reporter guidato da LTR) e pczVSV-G7. Per HIV-RFP VLP, utilizzare p8.91 8,9 (plasmide espressivo gag-pol), SCRPSY10 (plasmide reporter guidato da LTR) e pczVSV-G. Le alternative sono discusse nella tabella dei materiali. Potrebbe essere necessario ottimizzare i rapporti plasmidi per diversi sistemi plasmidi/trasfezione.
- Giorno 3 (tarda mattinata): Rimuovere accuratamente il fluido dalle celle mediante pipettaggio, lavare con 5 ml di DMEM fresco e sostituirlo con 5 ml di DMEM fresco.
- Giorno 4 (mattina): Raccogliere il virus raccogliendo il surnatante dalle cellule e sostituirlo con 5 ml di DMEM fresco. Far passare il surnatante contenente VLP attraverso un filtro da 0,45 nm, aliquote e trasferire a -70 °C per la conservazione. Assicurarsi che le aliquote siano di dimensioni adatte agli esperimenti pianificati (250 μL come suggerimento) poiché ripetuti cicli di congelamento-disgelo comporteranno una perdita di titolo virale.
- Giorno 5 (mattina): raccogliere il virus come in 1.5 ma scartare le piastre dopo aver raccolto il surnatante.
2. Titolo nuovo VLP prima dell'uso
- Giorno 1: Seme 293T a 2 x 105 cellule per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti - 4 pozzetti per virus da titolare, incluso un virus di infettività nota per ogni spina dorsale. Ottimizzare la densità di semina per un determinato stock di celle.
- Giorno 2: Osservare la piastra per verificare la confluenza (idealmente ~ 70%). Scongelare il surnatante contenente virus dai passaggi 1.5 e 1.6. Aggiungere 0, 10, 25 o 100 μL a ciascun pozzetto.
- Giorno 4 (mattina): Raccogliere le cellule per l'analisi mediante citometria a flusso.
- Rimuovere il supporto mediante un accurato pipettaggio o aspirazione. Lavare delicatamente le cellule con 250 μL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Rimuovere le cellule dalla piastra mediante pipettaggio su e giù con 250 μL di PBS e trasferirle in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere 250 μL di paraformaldeide al 4% (portando la concentrazione finale al 2%).
ATTENZIONE: La paraformaldeide è tossica. Non deve essere miscelato con disinfettanti a base di cloro. - Pellettare le cellule mediante centrifugazione a 500 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 μL di PBS o tampone citometrico a flusso alternativo. Analizzare RFP o YFP a seconda dei casi mediante citometria a flusso. Normalizzare l'infettività di un determinato stock di virus rispetto ai valori di uno stock di infettività nota.
NOTA: VLP può anche essere normalizzato mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico p24 (ELISA); tuttavia, questo non è necessariamente un buon indicatore dell'infettività dei VLP, specialmente quando le scorte di VLP sono preparate in diverse trasfezioni. I metodi pubblicati per la dose infettiva di coltura tissutale o la molteplicità dell'infezione (TCID50/MOI)11 possono anche fornire una quantificazione relativa, sebbene questi non siano ben stabiliti per MLV. La fluorescenza relativa fornisce un'alternativa economica ai metodi commerciali ELISA con trascrittasi inversa.
- Rimuovere il supporto mediante un accurato pipettaggio o aspirazione. Lavare delicatamente le cellule con 250 μL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Rimuovere le cellule dalla piastra mediante pipettaggio su e giù con 250 μL di PBS e trasferirle in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere 250 μL di paraformaldeide al 4% (portando la concentrazione finale al 2%).
3. Trasduzione di U937 con VLP che esprime SAMHD1 e YFP
NOTA: i passaggi da 3 a 6 costituiscono l'esperimento di restrizione. I giorni sono contati per facilitare la pianificazione.
- Giorno 1 (pomeriggio): Disgelo VLP per trasduzione inclusi MLV-Wild-type SAMHD1-YFP (controllo positivo), MLV-SAMHD1 (HD206-7AA)-YFP (controllo negativo) e variante MLV-SAMHD1-YFP (campioni sperimentali). Diluire il VLP normalizzato a un volume finale di 500 μL con il Roswell Park Memorial Institute 1640 media (RPMI) in un tubo microfuge, aggiungere 0,5 μL di polibrene (10 mg/ml) e mescolare mediante sfarfallio.
- Se VLP non può essere titolato in anticipo, utilizzare 100 μL in prima istanza. Utilizzare un rapporto massimo 1:1 tra VLP e RPMI per limitare la tossicità indotta da VLP. Puntare a circa il 30% di trasduzione.
- Aliquote 5 x 105 U937 cellule in un tubo di microfugo sterile per ogni condizione di trasduzione. Pellet mediante centrifugazione a 500 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante (includere due tubi aggiuntivi come controlli non trasdotti per la citometria a flusso). Risospendere il pellet cellulare in 500 μL di VLP diluito (o RPMI per controlli non trasdotti) e trasferirlo in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
- Spinoculare in centrifuga da tavolo a 800 x g per 90 minuti a 20 °C. Aggiungere 1 mL di RPMI a 37 °C nel pozzetto e lasciare recuperare in un incubatore a 37 °C per 3 giorni.
4. Differenziazione dell'U937 trasdotto
- Giorno 4 (mattina): Risospendere le cellule mediante pipettaggio delicato e trasferire 350 μL in ciascuno dei 4 pozzetti di una piastra a 12 pozzetti. Aggiungere 700 μL di RPMI a 37 °C contenenti 150 nM PMA ad ogni pozzetto ottenendo una concentrazione finale di 100 nM e lasciare differenziare per 3 giorni.
NOTA: il PMA viene acquistato come polvere e deve essere risospeso a 1 mM in DMSO e conservato al buio. Uno stock di lavoro di 100 μM deve essere preparato diluendo 1/10 dallo stock da 1 mM con DMSO.
5. Infezione di U937 differenziato, che esprime SAMHD1 con HIV-RFP
- Giorno 7: Osservare le cellule al microscopio. Assicurarsi che le celle siano aderenti. Aspirare il fluido da tutti i pozzetti, aggiungere 1 mL di RPMI al pozzo 1 di ogni set di 4 consentendo un controllo non trasdotto e non infetto e controlli a colore singolo. Aggiungere 0,5 ml di RPMI contenente circa 10 μL di HIV-1-RFP (circa 10 ng p24 come guida) a tutti gli altri pozzetti. Puntare a circa il 50% di infezione.
- Giorno 8 (mattina): Aggiungere 0,5 ml di RPMI a ciascuno dei pozzetti infetti.
6. Analisi della citometria a flusso
NOTA: È buona norma includere una macchia morta viva nelle condotte di citometria a flusso. Tuttavia, se le celle U937 sono di buona qualità, questo passaggio può essere omesso senza conseguenze negative per l'analisi a valle. Il pipettaggio delicato delle cellule tripsinizzate dovrebbe facilmente provocare una sospensione a singola cellula.
- Giorno 10 (mattina): aspirare il supporto dai pozzetti e lavare una volta con PBS. Aggiungere 300 μL di enzima di dissociazione cellulare (o tripsina) per 5-10 minuti. Aggiungere altri 300 μL di PBS, risospendere accuratamente assicurandosi che tutte le cellule si siano staccate dalla piastra e trasferirle nei tubi di citometria a flusso.
- Aggiungere 300 μL di paraformaldeide al 4% (portando la concentrazione finale al 2%). Pellettare le cellule mediante centrifugazione a 500 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 μL di PBS o tampone citometrico a flusso alternativo. Analizzare mediante citometria a flusso.
NOTA: i passaggi seguenti si riferiscono a un analizzatore Fortessa, ma è possibile ottenere analisi equivalenti utilizzando qualsiasi analizzatore in grado di leggere la fluorescenza RFP e YFP. Consultare il supporto locale di citometria a flusso o altri ricercatori esperti prima di impostare qualsiasi analisi di citometria a flusso. Quando è necessario eseguire lo screening di molti campioni contemporaneamente, può essere appropriato un campionatore ad alta produttività. In questo caso, si consiglia un numero e un volume di celle maggiori.
7. Analisi della citometria a flusso
- Accendere il citometro 10 minuti prima che sia richiesto e accendere il computer. Controllare che i rifiuti siano vuoti e che il serbatoio della guaina sia pieno.
- Accedere alla macchina e aprire il software di analisi.
- Spostare il braccio di lato, togliere il tubo dell'acqua, impostare la portata su Alta e premere Prime. Attendi che la luce si spenga e ripeti altre tre volte.
- Rimettere l'acqua e correre in alto per 3 minuti, quindi passare a Bassa e premere Standby fino a procedere all'acquisizione.
- Nel frattempo impostare l'esperimento all'interno del software:
- Selezionare Esperimento/Nuovo esperimento (nome in base alle indicazioni locali). Nell'ispettore, eliminare i fluorocromi non richiesti, lasciando Blue Laser 530/30 e Yellow Laser 610/20 o le combinazioni di laser e filtri consigliate per YFP e RFP per la macchina.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'esperimento e scegliere Impostazioni citometro/Impostazioni applicazione/Crea foglio di lavoro. Nel foglio di lavoro, creare una macchia di punti FSC-A (Forward Scatter-Area)/Side Scatter Area (FSC-A) e istogramma YFP, istogramma RFP e macchia di punti GFP/YFP facendo clic sull'icona corrispondente e modificando gli assi facendo clic sull'etichetta dell'asse.
- Fare nuovamente clic con il pulsante destro del mouse su Esperimento e aggiungere Nuovo campione. Rinominare in base alle esigenze. Aprire il campione facendo clic sul segno più per rivelare un nuovo tubo.
- Aprire il dashboard di acquisizione da View, caricare il controllo non infetto e non trasdotto e premere Acquisisci. Regolare le tensioni FSC e SSC nel quadro comandi per posizionare le celle nel quadrante inferiore sinistro (nessuna cella sugli assi). Porta intorno a questa popolazione P1. Fare clic con il pulsante destro del mouse su altri grafici e selezionare Mostra P1 per rimuovere i detriti dalle analisi successive.
- Caricare il controllo monocolore per YFP (solo SAMHD1 wild-type) e acquisirlo. Regolare la tensione YFP nel cruscotto in modo che la maggior parte delle celle fluorescenti si trovi all'interno della portata del rilevatore (non sul bordo dell'asse). Ripetere l'operazione per il controllo RFP a colore singolo.
- Esegui la compensazione automatica utilizzando i controlli non trasdotti, non infetti e monocromatici.
- Selezionare Sperimenta > Impostazione compensazione > Crea controlli retribuzione dal menu per passare a un normale foglio di lavoro. Selezionare il foglio di lavoro normale non macchiato, premere su Esegui e acquisire per il controllo non macchiato.
- Disegna un cancello attorno alle celle intatte (P1) e registra. Rimuovere il tubo e mettere la macchina in standby. Fare clic con il tasto destro su P1, fare clic su Applica a tutti i controlli di retribuzione.
- Passare al normale foglio di lavoro RFP e premere Esegui. Registrare il controllo RFP a un colore e mettere la macchina in standby. Il software dovrebbe selezionare automaticamente la popolazione positiva.
- Ripetere l'operazione per il controllo YFP a colore singolo. Seleziona Sperimenta > Impostazione compensazione > Calcola compensazione > collegamento e salva.
- Passare al foglio di lavoro globale. Acquisire le cellule trasdotte con wild type SAMHD1, infettate da HIV-RFP e verificare che quattro popolazioni distinte possano essere viste negli angoli dei quadranti che sono allineati verticalmente e orizzontalmente rispettivamente per YFP e RFP. Rimuovere il tubo e premere Standby.
- Ricarica il campione non trasdotto e non infetto, premi Esegui e registra 30.000 eventi con P1 come cancello di arresto. Ripetere l'operazione per i campioni rimanenti (inclusi gli altri controlli). Rinominare gli esempi durante l'esecuzione o post hoc. Una volta esportati, i file non possono essere rinominati.
- Esportare i dati come file .fcs e pulire la fluidica secondo le istruzioni locali.
8. Analisi dei dati
NOTA: i passaggi che seguono corrispondono all'analisi in FlowJo v10; Tuttavia, passaggi equivalenti possono essere facilmente eseguiti in altri software di analisi.
- Apri il software e trascina tutti i file .fcs nella dashboard. Selezionare i controlli di compensazione e trascinarli nella sottocartella di retribuzione. Aprire il file per il tubo non trasdotto e non infetto facendo doppio clic, che farà apparire il grafico FSC-A/SSC-A.
- Selezionate lo strumento poligono e gate sulla popolazione di celle intatta, esclusi i detriti nell'angolo in basso a sinistra. Denominare questa cellula. Trascinare questa porta sull'intera popolazione di tubi nella barra Tutti i campioni . Scorrere ogni singolo campione utilizzando i pulsanti freccia orizzontale per assicurarsi che il gating sia appropriato per ogni tubo.
- Fare doppio clic sulla popolazione di celle per il campione non trasdotto e non infetto e regolare gli assi su FSC-Height (H) vs FSC-Area (A). Selezionare la singola grande popolazione utilizzando un cancello rettangolare per escludere doppiette. Il software suggerirà automaticamente di nominare queste singole celle.
- Trascina questa porta su tutte le popolazioni di celle e, di nuovo, controlla che il gating sia appropriato per tutti i campioni. Selezionare la popolazione di celle singole per il campione non infetto e non trasdotto, modificare gli assi in laser blu compensato (y , YFP) rispetto al laser giallo compensato (x, RFP). Premete T sull'asse e selezionate Scala biesponenziale per x e y.
- Seleziona lo strumento Quadrant Gating Tool e fai clic all'estremità in alto a destra della popolazione di cellule negative. Applicare questo gating preliminare a tutte le popolazioni di celle singole trascinando nella barra Tutti i campioni . Laddove le porte dei quadranti non separano le popolazioni in modo soddisfacente, potrebbe essere necessario aprire i singoli quadranti usando lo strumento poligono, come nella Figura 2.
- Scorrere fino al campione SAMHD1 solo wild-type (solo YFP) e verificare che il gating tra il non trasdotto (YFP negativo) e YFP positivo sia corretto. Può essere utile passare alla visualizzazione del contorno per discriminare le celle YFP negative da quelle fioche. Se le celle YFP + ve più in alto sono ampiamente diffuse, regolare il gate verticale superiore verso destra.
- Scorri tutti i campioni e controlla il gating rispetto alla positività YFP. Utilizzare la migliore divisione tra YFP negativo e positivo valida per tutti i campioni.
NOTA: la compensazione sarà stata calcolata in base al livello di espressione YFP SAMHD1 wild-type. Se i livelli di infezione sono molto diversi tra le diverse cellule trasdotte SAMHD1-YFP, potrebbe essere necessario aggiustare la compensazione. È quindi preferibile che i VLP YFP siano normalizzati prima dell'uso. - Scorrere fino al tubo infetto da HIV-RFP non trasdotto e verificare se il gating tra RFP negativo non infetto e RFP positivo infetto è corretto. Regolate in base alle esigenze, utilizzando la vista di contorno, se necessario, e scorrete i campioni rimanenti per verificare che il gating sia valido per tutti i campioni.
- Ogni campione richiede doppi negativi (Q4: in basso a sinistra, non trasdotti, non infetti), YFP positivi (Q1: in alto a sinistra, SAMHD1 che esprime, non infetti), RFP-positivi (Q3: in basso a destra, non trasdotti, HIV infetti) e doppi positivi (Q2: in alto a destra, SAMHD1 che esprime HIV-infetto). Apri l'editor di tabelle facendo clic sull'icona e trascina le quattro porte del quadrante nella dashboard. Selezionare Excel Export e fare clic su Crea tabella. Salvare il foglio di calcolo generato in base alle convenzioni di denominazione dei file locali.
- Per esportare rappresentazioni di grafici e strategie di gating, fare clic sull'icona Editor layout . Seleziona ogni popolazione e trascinala nell'editor con gli assi, l'etichettatura e la spaziatura richieste.
- Per creare un layout con gli stessi grafici mostrati per tutti i campioni, selezionare una colonna e premere su Batch. Premere su Scala in larghezza e quindi evitare interruzioni di pagina. Salvare nel formato di file richiesto.
- Nel foglio di calcolo esportato, calcolare il rapporto di restrizione generando colonne di RFP percentuale di YFP-ves (RFP + ve / (doppi negativi + RFP + ve)) e RFP percentuale di YFP + ves (doppi positivi / (doppi positivi + YFP + ve)) e quindi una colonna finale di (%RFP di YFP + ve / % RFP di YFP-ve), vedere la Figura 1. Calcola la media dei dati di replica per ciascun costrutto SAMHD1 e calcola se i valori di restrizione per le varianti SAMHD1 testate sono significativamente diversi da quelli wild-type e/o 206-7AA utilizzando un software di analisi dei dati appropriato.
Representative Results
I risultati dell'analisi di cui sopra dovrebbero produrre un rapporto di restrizione di 0,25 o inferiore per il controllo positivo SAMHD1 wild-type e di 1,0 per il controllo negativo. Se questi due controlli di qualità sono validi, considerare la significatività statistica dei risultati. Le varianti SAMHD1 che non mostrano differenze significative rispetto al wild type portano quindi sostituzioni che non influiscono sulla restrizione SAMHD1 in questo contesto. Quelli significativamente diversi dal tipo selvaggio mostrano una restrizione compromessa. Se questi non sono significativamente diversi dal controllo negativo, allora non hanno la capacità di limitare in questo contesto (Figura 4 pannelli a sinistra).
Se il valore di restrizione SAMHD1 wild-type è maggiore di 0,3, i risultati per i virus tester possono essere indicativi ma non possono essere affidabili. Una restrizione inefficace da parte delle proteine wild-type può derivare dall'uso di cellule U937 troppo presto dopo il recupero dalla ricostituzione (entro 2 settimane) o quando sono troppo vecchie (>2-3 mesi). Potrebbe essere necessario determinare empiricamente questi parametri per un determinato stock cellulare. Tipicamente, più basso è il passaggio, più affidabile è la differenziazione delle cellule e quindi fornisce l'ambiente appropriato per la restrizione SAMHD1. Un livello di infezione inappropriato con SAMHD1-YFP o HIV-RFP può anche causare difficoltà sia con la compensazione che con la determinazione a valle del rapporto di restrizione. Un esempio è illustrato nei pannelli di destra della Figura 4.
Se il controllo negativo si discosta da 1,0 (al di fuori dell'intervallo 0,9-1,2), ciò potrebbe indicare un problema con l'analisi, la proporzione di cellule infette, la strategia di gating o la salute delle cellule stanno influenzando il test. Fare riferimento alle NOTE di cui sopra.
Figura 1: Schema del protocollo. VLP, particelle virus-simili, PMA, phorbol miristato acetato. Le fasi numerate corrispondono alle fasi del protocollo. Figura prodotta utilizzando BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Schema dei plasmidi retrovirali . (A) Vettori di imballaggio (B) Vettori di trasferimento (C) Espressivo di inviluppo VSV-G. Vengono mostrati gli elementi chiave di codifica e normativi. Per i dettagli fare riferimento alla Tabella dei materiali. CMV IE: promotore immediato precoce del citomegalovirus, BGH: ormone della crescita bovino, pA: polyA, RRE: Rev Response Element, CMV-LTR: promotore composito CMV-HIV-1 LTR, Psi: segnale di confezionamento HIV-1, cPPT/CTS: tratto polipurinico centrale/sequenza di terminazione centrale, SV40: virus vacuolante delle scimmie 40. Figura prodotta utilizzando BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Strategia di gating per l'analisi della citometria a flusso. (A) Controlli di compensazione: il pannello di sinistra mostra il gating FSC-A/SSC-A sulle cellule intatte per il controllo non trasdotto e non infetto. I pannelli centrale e destro mostrano schermate dei controlli di compensazione monocolore per YFP (medio) e RFP (a destra) con dati non compensati in nero e compensati in blu. (B) Matrice di compensazione corrispondente e grafici per i controlli di compensazione di cui sopra. (C) Strategia di gating. I detriti vengono eliminati attraverso l'analisi di tutte le celle mediante FSC-A/SSC-A (pannello di sinistra). Le doppiette sono escluse dal gating sull'altezza FSC rispetto all'area (pannello centrale). Il pannello di destra mostra un esempio di restrizione dell'HIV-1 da parte di SAMHD1 wild-type. Gli assi mostrano una fluorescenza laser blu e gialla compensata corrispondente rispettivamente alle cellule YFP (SAMHD1) e RFP (HIV)-positive. Le porte del quadrante vengono disegnate attraverso il confronto dei controlli negativi e monocromatici per RFP e YFP. I numeri indicano la percentuale della popolazione dei genitori. I valori di compensazione per YFP con GFP saranno molto più alti, ma è possibile discriminare utilizzando set di filtri appropriati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Risultati attesi: dati ideali e dati non ottimali. (A) Grafici rappresentativi YFP/RFP per dati ottimali (a sinistra) e subottimali (a destra). I numeri indicano la percentuale della popolazione dei genitori. Nel pannello di destra, l'infezione da HIV è troppo bassa creando difficoltà con la compensazione e il gating. Il rapporto di restrizione è superiore al previsto a 0,5. (B) Grafici del rapporto di restrizione per le varianti di SAMHD1 rispetto al tipo selvatico (WT, rosso) o al controllo negativo (HD206-7AA, nero) generato utilizzando software statistico. Ogni punto rappresenta un valore di replica. Vengono mostrate la media e la deviazione standard. I t-test accoppiati tra ciascun gruppo erano significativi in tutti i casi in cui mostrato. A sinistra: dati ideali - WT mostra la restrizione attesa di circa 0,2, negativo mostra 1,0. La variante R372D (grigia) è significativamente diversa da WT ma non significativa dal controllo negativo e quindi ha perso la capacità di limitare. A destra: dati non ottimali. Qui, il negativo si comporta come previsto, ma in tutte e sei le repliche il WT mostra solo un rapporto di restrizione di 0,5, a causa del basso tasso di infezione. La bassa varianza all'interno dei gruppi fa sì che R143H mostri un fenotipo intermedio statisticamente diverso dal WT e dal negativo, mentre G209S non restringe; Tuttavia, questo dovrebbe essere ripetuto con le cellule fresche poiché il controllo positivo non ha fornito il rapporto di restrizione atteso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussion
Come discusso nelle note precedenti, gli aspetti critici del protocollo si concentrano sul mantenimento del corretto fenotipo cellulare per la produzione di VLP e per la creazione dell'ambiente appropriato per osservare la restrizione SAMHD1. In primo luogo, l'analisi accurata della restrizione mediante citometria a flusso bicolore si basa sul raggiungimento di proporzioni appropriate di cellule trasdotte e infette in modo che ci siano abbastanza cellule in ogni area del grafico per l'analisi. In quanto tale, il ricercatore dovrebbe mirare a un MOI inferiore a 1 (vedi Protocollo). I tassi di trasduzione e infezione troppo alti o troppo bassi portano a problemi con l'analisi a causa della mancanza di cellule non infette o doppiamente infette. Allo stesso modo, un tasso di trasduzione simile per i vettori SAMHD1 da confrontare è la chiave per consentire l'applicazione della stessa matrice di compensazione e gating all'intero esperimento, aumentando la fiducia nell'analisi successiva.
In secondo luogo, l'età delle cellule U937 utilizzate è un fattore chiave per differenziarsi con successo. Il successo della differenziazione può essere monitorato attraverso l'osservazione dell'aderenza, una ridotta acidificazione dei mezzi nel tempo dopo la differenziazione e un'adeguata restrizione da parte del controllo positivo del tipo selvatico nel test. La differenziazione fino a 5 giorni ha avuto successo.
Uno dei principali vantaggi di questo test è la sua flessibilità. Una varietà di versioni modificate di SAMHD1 (domini, amminoacidi, sequenze di specie) possono essere testate tramite semplice mutagenesi sito-diretta del vettore o clonazione. Allo stesso modo, le varianti del virus tester possono essere esplorate. Il test è stato utilizzato in precedenza per dimostrare che i mutanti della trascrittasi inversa dell'HIV-1 con ridotta capacità di legare dNTP sono più sensibili alla restrizione SAMHD1. Lo stesso principio può essere utilizzato per testare la restrizione di altri virus mediante SAMHD1. Inoltre, condizioni di differenziazione variabili o manipolazione artificiale delle concentrazioni intracellulari di dNTP possono essere utilizzate per sondare ulteriormente l'interazione tra condizioni intracellulari e attività SAMHD1, un'area di ricerca attiva nel laboratorio di Bishop. È stata anche descritta l'interazione di SAMHD1 con vari inibitori nucleosidici della trascrittasi inversa e l'effetto di SAMHD1 mostrato utilizzando questo test modificato per l'uso nelle cellule primarie12,13,14,15.
L'adattamento del protocollo per l'uso nelle cellule primarie supera il limite posto dall'esame dei fenotipi metabolici nelle cellule trasformate. Tuttavia, il formato esistente consente un protocollo conveniente e meno impegnativo dal punto di vista tecnico per l'analisi ad alta produttività, in particolare con l'uso di un citometro a flusso con un campionatore ad alta produttività. Quando si adatta il protocollo, deve essere considerata la suscettibilità delle cellule internamente non trasdotte agli effetti degli astanti (ad esempio, segnalazione immunitaria).
Come per molti aspetti della biologia cellulare, è essenziale che tali saggi siano utilizzati come parte di un approccio olistico per comprendere un determinato fenomeno. L'uso parallelo di saggi biochimici per l'attività16 di SAMHD1, la quantificazione dei pool intracellulari di dNTP e l'osservazione dei fenotipi mutanti SAMHD1 nell'uomo, ex vivo e in modelli animali (condotti da laboratori di tutto il mondo, alcuni descritti in questo numero) sono fondamentali per la comprensione in evoluzione di questa complessa proteina.
Disclosures
Ai fini dell'Open Access, gli autori hanno applicato una licenza di copyright pubblica CC BY a qualsiasi versione del manoscritto accettato dall'autore derivante da questa presentazione. Le opinioni espresse sono quelle degli autori e non necessariamente quelle del NIHR o del Dipartimento della salute e dell'assistenza sociale.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Francis Crick Institute, che riceve i suoi finanziamenti principali da Cancer Research UK (FC001042 e FC001162), dal Medical Research Council del Regno Unito (FC001042 e FC001162) e dal Wellcome trust (FC001042 e FC001162) e da un Wellcome Trust Investigator Award a JPS (108012 / Z / 15 / Z). Il lavoro presso l'Università di Cambridge è stato co-finanziato dal NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) e UK Medical Research Council (MR / S009752 / 1). Quest'ultimo premio finanziato dal Regno Unito fa parte del programma EDCTP2 sostenuto dall'Unione europea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
| 10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance |
| 12 well plates | Greiner | 665180 | |
| 24 well plates | Greiner | 662160 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
| DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
| DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Flowjo | BD Bioscience | - | alternative analysis software can be used |
| light microscope | - | - | Any bright field light microscope |
| p8.91 | - | - | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
| paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
| polybrene | Sigma | TR-1003 | |
| pKB4 | - | - | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
| pLGatewaySAMHD1eYFP | - | - | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
| pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
- | - | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
| Prism | Graphpad | - | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
| pVSV-G | - | - | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
| RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
| screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
| SCRPSY | - | - | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/ |
| stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
| stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
| TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
| Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
| U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |
References
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