이 프로토콜은 성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를 위한 대동맥 통조림의 깊이를 포함하는 Langendorff 방법의 변형을 설명합니다.
단일 심근세포는 수축 및 전기 활동의 근본적인 단위로 심장 생물학 과 질병의 세포 및 세포 외 수준 연구에서 중요한 도구입니다. 따라서, 심장에서 실행 가능한, 고품질 심근 세포는 초기와 가장 중요한 실험 단계입니다 고립. 성인 마우스의 심근세포 를 분리하기 위한 다양한 프로토콜을 비교한 Langendorff 역행 성 구류는 특히 심실 심근세포를 분리하기 위해 문헌에서 보고된 가장 성공적이고 재현 가능한 방법입니다. 그러나, perfused 된 심혼에서 질 심방 심근세포를 격리하는 것은 도전남아 있고, 몇몇 성공적인 격리 보고는 유효합니다. 심실 질환을 제외하고, 심방 질환은 심장 질환의 큰 부분을 차지하기 때문에이 복잡한 문제를 해결하는 것은 매우 중요합니다. 따라서, 메커니즘을 밝히기 위해 세포 수준에 대한 추가 조사가 보증된다. 본 논문에서, 랑엔도르프 역행 관류 방법에 기초한 프로토콜이 도입되고 대동맥 통포심과 심방 근구를 분리하기 위한 소화 과정에 영향을 미칠 수 있는 단계들이 동시에 이루어졌다. 더욱이, 고립된 심근세포는 클램프 조사를 패치할 수 있는 것으로 확인되었다.
심장 질환은 사망의 주요 글로벌 원인 중 하나입니다1. 의료 시스템에 이 부담을 해결하기 위해 심장의 생리학과 병리학에 대한 심층적인 이해가 필수적입니다. 전체 동물과 온전한 심장 준비 외에도 세포 준비는 기능 및 질병 연구를위한 또 다른 필수 도구입니다2. 패치 클램프, 칼슘 이미징, 분자 생물학 및 기타 첨단 기술을 적용함으로써 연구자들은 단일 심근세포(CM)에서 전기 생리학적 특성, 칼슘 항상성, 신호 경로, 대사 상태 및 유전자 전사에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다. 이것은 심장 질병 프로세스의 생리적 및 병리학 적 메커니즘을 밝히는 데 매우 도움이됩니다3,4,5,6,7. 동물 연구를 위해, 작은 (예를 들어, 마우스, 쥐 및 기니 피그)에서 큰 (예를 들어, 토끼와 개)에 이르기까지 종을 사용할 수 있습니다. 작은 동물은 일반적으로 선호, 특히 마우스, 그들은 유전 및 질병 모델 조작에 순종하기 때문에8,9,10.
급성 격리 된 CM의 기술은 긴 개발 기간을 거쳤으며 여전히 진화하고 있습니다11. Langendorff 역행 관류는 쥐와 마우스에 적용되는 가장 성공적이고 재현 가능한 CM 격리 방법이며, 특히 심실 근세포(VM)12,13,14,15를 분리하는 데 사용됩니다. 그러나, 성공적으로 격리된 심방 근세포(AMS)의 보고는 부족16,17,18입니다. 전체 장기/시스템 및 세포/세포/세포/세포 에 대한 추가 조사는 기전을 드러내고 새로운 치료 접근법을 탐구하는 데 있어 가장 흔한 유형인 심방 세동(AF)이 전 세계적으로 점점 더 널리 퍼지고 있으며, 약리요법과 심장 절제 모두에서 현재 치료 양식은 약 40%-50%의 AF1 9%에서 효과가 없기 때문입니다. . 성공적인 성인 마우스 CM 격리는 셀룰러 연구를 위한 첫번째 단계입니다. 두 가지 기본 격리 방법을 사용할 수 있습니다: 청크 및 랑엔도르프 메서드. Langendorff 관류 방법에서 조직 소화는 관상 동맥과 그들의 가지가 모세관 침대에 전달한 효소 용액에 달려 있습니다. 대동맥 판막을 관통하고 관상 동맥 오스티아를 차단하는 것을 피할 수 있는 적절한 대동맥 통조림 깊이는 효율적인 소화와 이상적인 VM 수율을 위한 필수적인 단계인 관류 패턴을 달성하기 위한 전제 조건입니다. 따라서 대오르타 캐니어의 깊이가 아리아 선박의 관류에 유사하게 영향을 미치고 마지막으로 AM 수율에 영향을 미칠 수 있다고 가정하는 것이 합리적입니다. 이러한 가설을 테스트하기 위해, 다른 깊이에서 대어타 캐니언이 수행되었고 해당 AM 수율을 비교하였다. 데이터는 대자 통조림 깊이가 AM 수율과 직접 관련이 있음을 보여 주었다. 본 원에서, AMS와 VM을 동시에 격리하는 프로토콜이 도입된다.
단일 CM은 심장 기능 및 질병의 세포 수준 연구에서 귀중하고 필수 불가결한 도구입니다20. 따라서, 마음에서 실행 가능한 CM의 격리는 초기와 가장 중요한 단계입니다. 세포 질은 성공적인 실험을 수행하는 중요한 결정요인 중 하나입니다, 특히 광학 및 전기 생리실험에서. 다른 동물의 CM과 비교하여 설치류 심소는 Na+/Ca2+ 교환기를 통한 칼슘 유입을 선호하는 세포내 나트륨 이온의 농도가 높기 때문에 허혈과 저산소증에 더 취약합니다. 또한 AM의 수는 VM보다 훨씬 적습니다. 따라서 성공적인 격리는 달성하기가 매우 어렵습니다. Langendorff 방법은 마우스 VMs22를 격리하는 데 탁월하지만 AM을 격리하는 성공률은 낮으며 몇 가지 보고서를 사용할 수 있습니다. 대르타 캐넌트의 적절한 깊이는 완충 제고에 사용되는 온도, 효소 활성, PH 및 수질을 제외하고 이상적인 VM을 산출하는 데 필수적인 요소입니다. 랑엔도르프 방법의 원리는 심장의 역행 적 관류에 의존한다. 관류시 대동맥 판막이 닫힙시; 따라서, 난투는 관상 동맥으로 강제로 들어가 혈관 가지를 통해 효소 용액을 전달하며 심근 조직을 고르게 소화한다. 이러한 종류의 순환 패턴을 달성하기 위해 대동맥은 캐뉼레이션 및 결찰을 위해 충분한 길이를 예약해야 하며, 캐뉼라 팁은 대동맥 판막을 관통하거나 CA 오스트륨을 차단해서는 안 됩니다. 따라서, 대르타 통포의 깊이는 또한 아리아 관류와 연관되어 있다고 추측하는 것이 합리적이며, 이는 아리아의 소화 효능과 AM의 수율에 유사한 방식으로 영향을 미친다. 여기에 제시된 프로토콜은 가설을 확인했으며 제안과 함께 세포 수율을 최적화하기위한 중요한 단계는 아래에 나와 있습니다.
1.9 단계에서, 대동맥을 더 잘 고정하기 위해, 거리가 1mm인 곳에서 팁까지 노치(또는 둘레 홈)가 있는 무딘 20 G 캐뉼라를 추천한다. 우리의 경험에 기초하여, 대동맥의 직경보다 약간 더 큰 캐뉼라 크기는 대동맥 이절 동안 대동맥 판막을 뚫는 것을 막기 위해 발견되었는데, 이는 대동맥이 내장탄성에 의존하여 캐뉼라에 잘 맞고 앞으로 움직일 때 보호 요인으로 작용하여 마찰을 일으킵니다. 노치의 위치의 관점에서, 심장은 캐뉼라 팁에 너무 가까운 경우 중력 때문에 통조림 중에 쉽게 미끄러집니다. 반대로, 캐닝 깊이및 결찰 위치를 조정하는 공간은 너무 멀리 가면 매우 제한됩니다. 이러한 상황을 감안할 때, 좌측 일반적인 경동맥( 도 2의 그린 라인)을 대동맥사이로 대관하는 것은 대동맥이 충분히 길고 승천 대동맥에서 칸누우고 결찰될 수 있도록 3.3단계에서 더 낫다. 오름차순 대동맥에서 대회하는 반면, 캐뉼레이션을 위한 예약 된 길이는 적어도 대동맥 뿌리에 가까운 캐뉼라 팁을 고정할 수 있으며 결찰 후 대동맥 판막을 관통하지 않습니다. 대동맥의 해부학과 캐뉼라 팁에서 CA 오스트리움까지의 거리의 측정은 좌측 일반적인 경동맥 사이대동맥을 비장염시키는 것이 적절한 대동맥 수분 깊이를 달성하기에 이상적인 위치임을 나타낸다.
수분 깊이는 아리아의 관류와 연관되는 것으로 나타났으며, 이는 차례로 깊이 표시기역할을 한다. 도 4 는 심도가 상승 대오르타에 있을 때 아리아 관류가 좋고 심방 부속서가 팽창된다는 것을 보여줍니다. 그러나, 심도가 대동맥 뿌리에 있을 때(또는 접근)하고 심방 부속서가 모두 비정할 때 동맥 관류는 불충분하다. 팽창된 심방 부속물에서 산출된 AM의 총 및 실행 가능한 수는 더 높았습니다(그림 8). 이러한 연구 결과는 대마 통포 깊이가 특정 방식으로 심방 부속기의 관류 및 소화에 영향을 미치고 마침내 AM 수율과 품질에 영향을 미칠 수 있음을 나타냅니다. AM의 수율과 품질은 아리아를 공급하는 선박의 분포와 관련이 있다고 추론되었다. 페르난데스 외.23 의 연구는 마우스 CA의 기원과 과정에서 다양한 이상을 입증했다. 그(것)들은 CAs ostia가 높게 가변적이고 모두 대동맥 부비동에 있지 않다는 것을 것을을 발견했습니다. 일부 CA는 대동맥 부비동 위에서 비정상적인 것으로 유래할 수 있으며, 높은 이륙 오스티움이라고 명명되었습니다. 일부 카라는 동일한 대동맥 부비동에서 유래할 수 있으며 아트리움 선박의 타륨은 바로 근처에 있습니다. 본 연구에서 대어의 해부학 (그림 10) 또한 페르난데스의 발견과 일치. 이는 랭엔도르프 법에 의한 AM을 격리하려는 시도가 캐너레이션 깊이가 적절하지 않은 경우 크게 실패한 원인이 될 수 있다. 따라서, 캐뉼라 팁은 캐뉼라 팁과 CA 오스트리움 사이에 충분한 공간이 없다면 CA 오스트륨에 인접한 아트리움 혈관 타당을 차단할 확률이 더 크다. 대조적으로, 대동맥 판막이 캐뉼라 팁에 의해 침투되지 않는 한 심실의 관류 및 세포 수율은 거의 영향을 받지 않았다. 이것은 아마 심실에 혈액을 공급하는 CA가 더 큰 ostia 및 더 많은 기원이 있기 때문일 것입니다. 한 개의 타골이 캐뉼라에 의해 가려진 경우, 심실 관류는 다른 CA 또는 부수적 순환에 의해 보상될 수 있는 반면, 아트리움을 공급하는 혈관은 다소 작고 대체품이 없습니다. 따라서 대오르타 캐니튜레이션에 깊이의 영향이 중요하다.
소화 및 세포 저장 공정에서 다른 주목할만한 요인과 문제 촬영은 다음과 같이 나열됩니다. 첫째, 근육 계약을 하고 아리아의 혈액이 대르타 결찰 후에 돌진되지 않은 경우 잔류 혈액을 펌핑하기 위해 4.1 단계에서 산소티로드의 용액을 인하여 사용하는 것을 고려하십시오. 이것은 손상된 적혈구에서 풀어 놓인 ca2+ 및 그밖 물자의 부작용을 방지하는 것을 도울 수 있습니다. 둘째, CA2+없는 용액을 미리 침투하여 연결을 분리하고 세포 간 공간을 확장하면 CM 간의 상호 작용 디스크가 칼슘 의존식 세포 간 접합이기 때문에 효소 소화의 효능을 향상시킬 수 있습니다. 그러나 칼슘 역설 현상을 피하기 위해 3-5분으로 제한해야 한다.24. 혼합 효소 용액을 권장합니다. 콜라게나아제 타입 II는 세포외 매트릭스 네트워크를 방해하고, 트립신은 콜라게나아제 II 소화가 불완전한 경우 세포 표면에 남아있는 세분화된 물질을 지우는 데 도움이 됩니다. 이렇게 하면 패치 클램프 레코딩에서 GΩ 씰을 형성하는 데 중요한 매끄러운 셀 표면이 보장됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 트립신 농도 막 단백질을 저하시킬 수 있기 때문에 소화 와 세포 손상을 피하기 위해 적절 한 범위에서 제어 해야 합니다. 콜라게나아제 타입 II를 단독으로 사용하여 세포 수율을 향상시키는 것은 종종 소화를 통해 조직으로 이어질 수 있으며, 격리된 CM은 콜라게나아제 노출25를 연장한 후 칼슘 내성이 될 것이다. 미오신 ATPase를 억제하고 교단 형성을 방지하여 자발적수축을 방지하는 물질인 2,3-부탄단 단조음(BDM)의 사용은 여전히 논란의 여지가 있다26,27,28,29. 이전 경험에 따르면 이 프로토콜에 BDM을 추가하는 것이 필요합니다. 효소 용액은 용액 1을 사용하여 제조되지만 용액 1은 칼슘을 포함하지 않으며, 효소를 활성화하기 위해 칼슘을 첨가한다. 관류 용액에 BDM을 첨가하는 이점은 (1) 효소 용액 관류 동안 근구 수축을 억제하고 산소 소비를 감소시키고 (2) 저산소증에서 심세포를 방지하고 격리된 심근세포의 품질을 향상시키는 것을 포함한다. 일부 연구는 BDM 세포 전기 속성에 잠재적인 불리 한 영향을 미칠 수 있습니다 보고. 그러나, 나트륨 전류의 전세포 패치 클램프 기록의 결과는 바람직하지 않은 효과를 나타내지 않았다. 세포 저장 단계(6단계에서)에서, 칼슘이 없지만 높은 칼륨 농도 용액인 KB 버퍼를 선택하여 세포가 편광되고 낮은 대사 조건에 있기 때문에 더 나은 상태를 유지할 수 있다. 그러나, 세포막의 글리코칼릭스는 일정 시간 동안 외인성 칼슘이 없는 지질 이중층으로부터 분리되며 멤브레인 투과성이 증가하여 후속 기능 분석에 영향을 미칠 것이다30,31,32.
모든 근세포 절연 기술은 효소 용액또는 효소 용액(Langendorff 관류)22를 가진 CA 관류에서 현재 두 덩어리(작은 조직의 작은 조각) 소화로 분류될 수 있다. Langendorff 방법과 비교하여 청크 소화 방법은 수행하기가 더 쉬울 수 있으며 많은 실험실에서 CM을 격리하는 데 일상적으로 사용됩니다. 그러나,이 방법은 일반적으로 성인 조직에서 가난한 품질의 CM의 낮은 수율을 생성22. 더욱이, 이 방법에 의해 분리된 세포는 비교 실험을 수행하기에 적합하지 않을 수 있다. 예를 들어, AM과 VM 사이의 세포 유형 별 약물 효과를 테스트할 때, 상이한 격리 조건의 영향을 무시하거나 배제할 수 없다. 이는 심실의 심근과 조직 밀도가 아트리움보다 훨씬 두껍고 밀도가 높기 때문에 소화 시간과 효소 농도가 다르기 때문입니다. 더욱이, 소화 중 조직의 과도한 동요와 배관은 세포를 손상시키고 기능 연구에 크게 영향을 미칩니다. 더욱이, 많은 이전 연구는 AMS가 칼슘에 더 취약하다는 것을 보여주었습니다. 그러나, 현재 프로토콜에 의해 분리된 AMM은 소화 과정의 끝에 조직이 파열되기 쉽기 때문에 아마 그라데이션 칼슘 재도입에 관대할 수 있다. 따라서, 기계적 손상은 덜, 반면 세포는 청크 방법의 단계가 반복 파열 및 원심을 필요로하기 때문에 더 많은 기계적 손상을 겪을 것이다. 최근에는 Ackers 외.33이 실행 가능한 심장 근세포 및 비근구체의 분리를 위한 단순화된 랑엔도르프 프리 방법을 보고했습니다. VM과 섬유아세포는 효과적으로 분리될 수 있지만, AM의 양은 언급되지 않았다. 그러나 이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 심장 혈관의 분포는 개별적인 다름 및 마우스 긴장에 대한 변이를 가질 수 있고, 추천된 캐너레이션 깊이는 매번 성공적인 AMM 격리를 보장할 수 없다. 둘째, 이 절차에 익숙하지 않은 사람들을 위해 대동맥 절제술을 연습하고 대동맥을 역행하는 데 일정 시간이 걸릴 수 있습니다. 마지막으로, 이 방법은 건강하고 노인 마우스를 제외하고 다른 심장 질환 모델에서 테스트되지 않았습니다. 따라서, 그것은 효소 농도와 심장의 섬유증 정도 때문에 소화의 시간에 조정을 필요로 할 것 이다. 청크 방법에 발생하는 상이한 소화 조건의 단점은 효소 용액이 혈관 침대에 의해 조직에 균등하게 분포되는 Langendorff 방법에서 문제가 되지 않을 것이다.
요약하자면, 여기에 설명된 단일 AM 및 VM의 동시 절연을 위한 프로토콜은 적절한 대오르타 수분 깊이가 아트리움 관류 및 AM 수율을 효과적으로 향상시킬 수 있음을 입증하였다. 이 방법에 의해 분리 된 CM은 고품질이며, 좋은 칼슘 내성을 가지고 있으며, 성공적으로 ionOptix 시스템에 의해 패치 클램프 레코딩 및 칼슘 처리 (Ca2 + 릴리스 및 Ca2 + 웨이브 측정)에 적용되었습니다34. 격리 프로토콜은 일련의 세포 및 세포 세포 조사에서 세포 준비를 위해 사용될 수 있으며, 이는 심장 생리학 및 병리학에 대한 이해를 심화시키는 데 도움이 될 것입니다. 중요한 것은, 그것은 더 임상적으로 관련있는 심장병 기계장치 및 내정간섭 방법의 발견을 가능하게 할 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81770322, 81870244, 81500254, 81870243, 81470465) 및 베이징 자연과학 재단(no. 7192051)의 보조금으로 지원되었습니다. 저자 기여: 바이와 리우는 이 프로젝트를 설계하고 구상했습니다. 웬과 루안은 실험에 귀중한 조언을 제공했다. 우와 린링 리는 실험작업을 수행하고 데이터 수집, 분석 및 해석에서 핵심적인 역할을 수행했습니다. 리 리는 랑엔도르프 장치 조립에 참여했다. 펑, 장, 왕, 양은 실험 전에 시약과 솔루션의 준비에 참여했다. 우는 기사를 썼다.
2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | 31550 | |
Bull Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Collagenase type II | Worthington | 43D14160 | |
Excel | data acquisition and analysis | ||
Fetal Bovine Serum (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 150207 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
KHCO3 | Sigma-Aldrich | 237205 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA,US | data acquisition and analysis | |
Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
Sodium pentobarbital | Shanghai Reagent Factory | 810923 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Trypan blue | Solarbio | C0040 | |
Trypsin | Invitrogen | 15090046 | |
Water bath | JULABO | ED (v.2) |