Tinción del Ca2+ citoplasmático con Fluo-4/AM en pulpa de manzana

Summary

Los protoplastos aislados de células de pulpa de manzana se cargaron con un reactivo fluorescente de calcio para detectar la concentración citoplasmática de Ca^2+.

Abstract

El Ca²⁺ citosólico juega un papel clave en el desarrollo de las plantas. La imagen de calcio es el método más versátil para detectar cambios dinámicos en Ca²⁺ en el citoplasma. En este estudio, obtuvimos protoplastos viables de células pulpares por hidrólisis enzimática. Los protoplastos aislados se incubaron con el reactivo fluorescente de molécula pequeña (Fluo-4/AM) durante 30 min a 37 °C. Las sondas fluorescentes tiñeron con éxito el Ca²⁺ citosólico pero no se acumularon en las vacuolas. La^3+,un bloqueador de los canales de Ca^2+, disminuyó la intensidad de la fluorescencia citoplasmática. Estos resultados sugieren que Fluo-4 / AM se puede utilizar para detectar cambios en ca^{2 +} citosólico en la pulpa de la fruta. En resumen, presentamos un método para aislar eficazmente los protoplastos de las células de la carne de la fruta y detectar Ca^{2+ cargando} un reactivo fluorescente de calcio de molécula pequeña en el citoplasma de las células pulpares.

Introduction

Ca²⁺ juega un papel importante en la transducción de señales y el metabolismo^{de las plantas 1,2}. Además, regula los rasgos de calidad de la fruta^3,4, incluida la dureza, el contenido de azúcar y la susceptibilidad a los trastornos fisiológicos durante el almacenamiento^5,6. El Ca²⁺ citoplasmático juega un papel importante en la transducción de señales y regula el crecimiento y desarrollo de las plantas⁷. La alteración de la homeostasis del calcio celular puede inducir hueso amargo en manzanas^8,enfermedad de manchas marrones en peras⁹y pudrición umbilical en tomates^10,afectando la calidad de la fruta y causando graves pérdidas económicas^3,11. Las imágenes de calcio tienen suficiente resolución espacial y temporal y es un método importante para observar la dinámica de Ca²⁺ en células vivas^12,13.

En la actualidad, hay dos métodos principales para la obtención de imágenes de calcio intracelular en células vivas: uno emplea sondas fluorescentes químicas de pequeño molecular¹⁴, y el otro es el sensor de codificación de genes (GECI)^15,16. Dada la dificultad de establecer un sistema transgénico estable en los árboles frutales y un desarrollo más largo de la fruta, GECI_S no es adecuado para la obtención de imágenes de fluorescencia Ca²⁺ de la fruta.

Las sondas fluorescentes de moléculas pequeñas como Fluo-4/AM tienen una ventaja particular: su forma de éster AM (derivado del acetoximetilo éster permeable a las células) puede cargarse fácilmente a granel en las células vivas sin necesidad de transfección, lo que la hace flexible, rápida y no citotóxica¹⁷. Fluo-4 / AM podría cargarse con éxito en el tubo de polen de Pyrus pyrifolia¹⁸ y Petunia,^19, así como en las células de guardia²⁰ y el vello de la raíz de Arabidopsis^21.

En la actualidad, hay pocos informes sobre la tinción de fluorescencia de calcio de las células pulpares²². Como elemento mineral importante, el calcio juega un papel clave en el crecimiento y control de calidad de los frutos de los árboles como las manzanas. Los manzanos son reconocidos mundialmente como una especie económica importante, y las manzanas se consideran un alimento saludable²³. En este estudio, obtuvimos protoplastos viables de pulpa de fruta de manzana a través de hidrólisis enzimática y luego cargamos reactivos fluorescentes de moléculas pequeñas en el citoplasma para detectar Ca^{2 +.}

Protocol

1. Extracción de protoplastos Preparar la solución básica: 20 mM De CaCl2, 5 mM de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico y 0,4 M de D-sorbitol.NOTA: El pH de la solución básica se ajustó a 5,8 con tampón Tris de 0,1 M, se filtró a través de filtros solubles en agua de 0,22 μm y se almacenó a 4 °C. Preparar la solución enzimática: Mezclar 0,3% (p/v) Macerozyme R-10 y 0,5% (p/v) celulasa R-10 con la solución básica. Añadir 0,5 ml de solución en…

Representative Results

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, utilizamos el método enzimático para obtener protoplastos viables de la pulpa (Figura 1). Algunos protoplastos tenían vacuolas, mientras que otros no. Mientras que los protoplastos no exhibieron fluorescencia cuando el indicador fluorescente Ca2 + no se cargó en ellos. Cuando Fluo-4/AM se cargó en los protoplastos, el citoplasma, pero no la vacuola, se volvió fluorescente (Figura 2). Este resultado …

Discussion

En este estudio, se obtuvieron protoplastos viables por hidrólisis enzimática. Tenga en cuenta que este método requiere manzanas frescas. El presente protocolo permite el aislamiento rápido de un gran número de protoplastos de pulpa de fruta para su uso en estudios de investigación. La aplicabilidad de este método no se limita a ‘Fuji’; los protoplastos de la pulpa de manzana de ‘Dounan’ y ‘Honey Crisp’ también se pueden extraer a través del mismo protocolo(Figura suplementaria S4). La solución…

Materials

10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.