פרוטוקול זה נועד להיות כלי לחקר סטאטוזיס ואת השינויים המולקולריים, הביוכימיים, התאיים המיוצרים על ידי חשיפה יתר של hepatocytes שומנים במבחנה.
מחלת כבד שומני (MAFLD), הידועה בעבר כמחלת כבד שומני לא אלכוהולית (NAFLD), היא מחלת הכבד השכיחה ביותר בעולם בשל הקשר שלה עם השמנת יתר, סוכרת מסוג 2, ודיסליפידמיה. סטאטוזיס כבד, הצטברות של טיפות שומנים בדם בפרנצ’ימה בכבד, היא תכונה מרכזית של המחלה שקדמה לדלקת שנצפו בteatohepatitis, פיברוזיס, ומחלת כבד סופנית. הצטברות שומנים בדם בהפטוציטים עלולה להפריע לחילוף חומרים תקין של קסנוביוטיקה ומולקולות אנדוגניות, כמו גם לגרום לתהליכים תאיים המובילים להתקדמות המחלה. למרות המחקר הניסיוני של steatosis יכול להתבצע vivo, במבחנה גישות לחקר steatosis הם כלים משלימים עם יתרונות שונים. תרבות hepatocyte במדיום מותנה עומס יתר שומנים היא אפשרות רבייה מצוינת לחקר הסטאטוזיס הכבד המאפשר זיהוי של תהליכים תאיים הקשורים הצטברות שומנים, כגון לחצים חמצוניים ורשתית, autophagia, התפשטות, מוות תאים, וכו ‘, כמו גם בדיקות אחרות כולל יעילות סמים, ובדיקות טוקסיקולוגיות, בין יישומים אפשריים רבים אחרים. כאן, הוא נועד לתאר את המתודולוגיה של תרבית התא hepatocyte במדיום מותנה עומס יתר שומנים. תאי HepG2 היו בתרבית RMPI 1640 בינוני מותנה עם נתרן פלמיטט ונתרן oleate. חשוב לציין, היחס של שני שומנים אלה חיוני כדי להעדיף הצטברות טיפת שומנים בדם, תוך שמירה על התפשטות התאים ושיעור תמותה מתון, כפי שקורה בכבד במהלך המחלה. המתודולוגיה, מהכנת מלאי פתרון השומנים, תערובת, תוספת לתרבות הבינונית וההפטוציט מוצגת. עם גישה זו, ניתן לזהות טיפות שומנים בדם בהפטוציטים שניתן להבחין בהם בקלות על ידי כתמי O אדומים שמן, כמו גם עקומות של שיעורי התפשטות / תמותה.
כבד שומני הקשורים בתפקוד המטבולי נפוץ מאוד ברחבי העולם1,2; ההערכה היא כי עד 25% מהאוכלוסייה מושפע3. מחלה זו הידועה בעבר בשם מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD), עדכנה את המינוח שלה לתפקוד מטבולי הקשור למחלת כבד שומני (MAFLD) כדי לשקף במדויק את הפתוגנזה הקשורה להשמנת יתר, תנגודת לאינסולין, סוכרת מסוג 2, ודיסליפידמיה, כמו גם את ההנהלות האפשריות של המחלה3,4.
ללא קשר לשם, המחלה כוללת קשת רחבה של שינויים היסטופתולוגיים המאופיינת בהצטברות גבוהה באופן חריג של שומנים בכבד (>5% מהשומן בהפטוציטים5) ועשויה להתקדם דרך הצטברות השומנים שנמצאת בדרך כלל בסטאטוזיס פשוט לסטיאטוהפטיטיס, אשר בתורו עלולה להוביל להתפתחות של פיברוזיס, שחמת הכבד, קרצינומה hepatocellular, ואי ספיקת כבד5,6,7,8. בשל שכיחותו הגוברת, MAFLD צפוי להיות האינדיקציה הראשונה להשתלת כבד והגורם המוביל לקרצינומה hepatocellular9.
למרות שזה נחשב כצורה שפירה או קלה של מחלת כבד שומני, סטאטוזיס כבד הוא למעשה המפתח המטבולי ב- MAFLD10. מסלולים מטבוליים שונים מושפעים הצטברות שומנים בדם בכבד, כולל אך לא מוגבל סינתזה שומנים בדם, ייצוא, חילוף החומרים10. תנגודת לאינסולין, עקה חמצונית, מתח רשתית, תפקוד לקוי הסלולר קשורים מאוד ליפוטוקסיות בכבד11,12. מצד שני, הפטוסיטים שומניים הם המטרה של מינים חמצן תגובתי, עיבוד מטבוליטים כמו מי חמצן שומנים, קרבונילים חלבון, ותוספים של חומצות גרעין13. ברמה התאית, hepatocytes שומני עלול לעבור נזק מיטוכונדריאלי14, senescence הסלולר15, אפופטוזיס16, pyroptosis12, ו autophagia17, בין שאר האירועים.
Hepatocytes אחראים מאוד על חילוף החומרים, detoxification, וסינתזה של מגוון רחב של מולקולות. רבים של פונקציות אלה עלולים להיות בסכנה על ידי הצטברות השומנים שנצפו בסטאטוזיס. לכן, יש חשיבות רבה יש כלים לשחזור המאפשרים הערכה מדויקת של סטאטוזיס. במובן זה, מודלים במבחנה ישימים בקלות וניתן לשחזר מאוד. סטאטוזיס במבחנה שימש עם מטרות שונות16,18,19. תאי HepG2 נמצאים בשימוש נרחב כקו תאים hepatocyte. יש לו יתרונות כגון להיות קל לתרבות ומאופיין היטב. אולי, החיסרון היחיד של תאי HepG2 הוא העובדה שזה קו תאים מסרטן, ולכן זה חייב להילקח בחשבון בעת ניתוח התוצאות. כאן, היישום של תערובת של חומצות שומן בשימוש נרחב בתרבות התא: חומצה פלמיטית (PA) וחומצה אולאית (OA) מוצג. הן הרשות הפלסטינית והן OA מציעות תוצאות שונות בתרבות20. PA (C 16:0) היא חומצת השומן הרווי הנפוצה ביותר המתקבלת מהתזונה16. הרשות הפלסטינית נחשבת סמנים ביולוגיים של דה נובו ליפוגנזה, צעד מכריע בהתפתחות NAFLD21. הרשות הפלסטינית מוצגת כבעלת22רעילים ביותר ; לכן, זה לא יכול להיות מומלץ לגרום סטאטוזיס במבחנה. OA (C 18:1) היא חומצת שומן חד בלתי רוויה. בניגוד לרשות הפלסטינית, הוצע ל-OA להחזיק בתכונות אנטי דלקתיות ונוגדי חמצון, להיות מסוגל לנטרל את PA12. הן PA והן OA הן חומצות השומן העיקריות הקיימות בטריגליצרידים, ללא קשר למצב הבריאות אוהמחלה 16. טבלה 1 מספקת דוגמאות לתרבות ההפטוציטים עם הרשות הפלסטינית, OA והתערובת שלהם, כמו גם התוצאות שדווחו12,23,24,25,26,27. חומצות שומן אחרות שימשו גם בתרבות הפטוציט, כולל חומצה קאירית (C 18:0)28,29,30, חומצה לינולאית (C 18:1)28,30,31 וההצמדות שלה (CLA)28,32, חומצה פלמיטולאית (C 16:1)29. עם זאת, השימוש בהם מדווח לעתים קרובות ביותר בספרות, אולי בגלל שפע הכבד שלהם נמוך יותר מאשר הרשות הפלסטינית ו OA16.
בשילוב, שתי חומצות השומן דומות לסטיאטוזיס במבחנה, ומספקות תאים מתרבים, עם מוות מוגבר של תאים וכדאיות נמוכה יותר בהשוואה לתנאי בקרה. ראוי להזכיר כי המלחים המתאימים של חומצות שומן אלה זמינים וניתן להשתמש בהם גם כן. אחת הבעיות העיקריות בעת הערכת עומס יתר שומנים בתרבית התא hepatocyte ניתנת בהבחנה בין מודלים טוקסיקולוגיים מודל המייצגים הטוב ביותר סטאטוזיס. מודלים רבים ניתן להסביר במקרה הראשון. למעשה, השימוש ברשות הפלסטינית לבדה עשוי להיחשב ביניהם, והתמותה הגבוהה היא התוצאה הברורה ביותר12,16,23,24,25,26,27. השימוש במינונים גבוהים גם במקרה של OA יכול להיחשב גם כמודל toxicologic. הפרוטוקול המוצג כאן הוא גבוה יותר בהתאם להתפתחות סטאטוזיס שכן הוא מראה תמותה נמוכה לעומת זה שנצפה במודלים אחרים ומאפשר לו להיות אחריו במשך מספר ימים עם הצטברות שומנים מתקדמת כפי שהוא מתרחש ב NAFLD. האפשרות להעריך סטאטוזיס קל וחמורה באמצעות תנאי ניסוי נחשבת יתרון נוסף.
חומצות שומן | תנאים | תוצאות | הפניה | ||
אבא | ריכוז: 200 מיקרומטר | הצטברות שומנים בדם | יאן ואח’, 201925. | ||
חשיפה לזמן: 24 שעות | נזקי הפטוצייט | ||||
גובה טרנסמינאס | |||||
אבא | ריכוז: 50, 100 ו 200 מיקרומטר | הצטברות שומנים בדם | Xing et al, 201924. | ||
חשיפה לזמן: 24 שעות | |||||
אבא | ריכוז: 250 מיקרומטר , 500 מיקרומטר , 750 מיקרומטר ו 1,000 מיקרומטר | הצטברות שומנים בדם | וואנג ואח’, 202026. | ||
חשיפה לזמן: 24 שעות | הפחתה הדרגתית של הכדאיות בתא | ||||
תערובת של OA/PA | ריכוז: 1 מ”מ | הצטברות שומנים בדם | שיאו ואח’, 202027. | ||
חשיפה לזמן: 24 שעות | אינו מדווח על ליפוטוקסיות | ||||
מחיר: 2OA:1PA | |||||
תערובת של OA/PA | גירוי ראשון עם 200 מיקרומטר ו 400 מיקרומטר של PA ולאחר מכן גירוי שני עם 200 מיקרומטר של OA | הצטברות שומנים בדם. | זנג ואח’, 202012. | ||
ריכוז:400 מיקרומטר PA: 200 מיקרומטר OA | ראיות של ליפוטוקסיות הנגרמת על ידי הרשות הפלסטינית צומצמה על ידי גירוי של OA. | ||||
תעריף: 2PA:1OA | |||||
חשיפה לזמן: 24 שעות | |||||
תערובת של OA/PA | ריכוז: 400 מיקרומטר PA: 200 מיקרומטר OA | הצטברות שומנים בדם | חן ואח’, 201823. | ||
תעריף: 2PA:1OA | |||||
חשיפה לזמן: 24 שעות | |||||
תערובת של OA/PA | ריכוז :50 ו 500 מיקרומטר | דור של שני סוגים של סטאטוזיס: סטאטוזיס קל ו סטאטוזיס חמור. |
קמפוס וגוזמן 2021 | ||
תעריף: 2PA:1OA | מדמה תערוכה כרונית של עומס שומנים | ||||
חשיפה לזמן: 24 שעות, יומיים,3 ימים ו-4 ימים. |
טבלה 1. תרבות הפטוצייט בתנאים סטטוגניים. הטבלה מציגה את סוג חומצת השומן המשמשת, את התנאים נשמרים, ואת התוצאות שנצפו בתרבות hepatocyte. חומצה פלמיטית. חומצה אולאית.
לבסוף, מודל זה ישים לא רק על המחקר של סטאטוזיס וכבד שומני, אלא גם על מסלולי חילוף החומרים הכבד, סינתטי, ו detoxification בהקשר של סטאטוזיס. כמו כן, בסטאטוזיס המושרה במבחנה עשוי לספק ראיות לזיהוי סמנים פוטנציאליים של המחלה, כמו גם מטרות טיפוליות.
פרוטוקול זה נועד לספק אסטרטגיה לחקר סטאטוזיס במבחנה. תרבית התאים היא כלי רב עוצמה לחקר היבטים תאיים, מולקולריים, ביוכימיים וטוקסיקולוגיים של התאים החשופים לתנאים שונים. עם גישה זו, ניתן לדמיין סטאטוזיס לא רק כשלב של המחלה המורכבת שהיא MAFLD, אלא גם כמו חשיפת יתר hepatocyte שומנים ואת התוצאות …
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). אדריאנה קמפוס היא דוקטורנטת ב-Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, באוניברסיטת נאסיונאל אוטונומה דה מקסיקו, ונתמכה על ידי קונאסיאט (CVU: 1002502).
Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | – |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | – |
Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | – |
HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | – |
Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | – |
Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | – |
Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | – |
Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | – |
Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | – |
Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | – |
Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | – |
Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | – |
24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |