Quantification des densités cellulaires et des propriétés antigéniques par lévitation magnétique

Summary

Cet article décrit une méthode basée sur la lévitation magnétique qui peut détecter spécifiquement la présence d’antigènes, solubles ou liés à la membrane, en quantifiant les changements dans la hauteur de lévitation des billes de capture avec des densités fixes.

Abstract

La méthode décrite a été développée sur la base des principes de la lévitation magnétique, qui sépare les cellules et les particules en fonction de leur densité et de leurs propriétés magnétiques. La densité est une propriété d’identification de type cellulaire, directement liée à son taux métabolique, à sa différenciation et à son statut d’activation. La lévitation magnétique permet une approche en une étape pour séparer, imager et caractériser avec succès les cellules sanguines circulantes, et pour détecter l’anémie, la drépanocytose et les cellules tumorales circulantes en fonction de la densité et des propriétés magnétiques. Cette approche se prête également à la détection d’antigènes solubles présents dans une solution en utilisant des ensembles de billes de faible et haute densité recouvertes d’anticorps de capture et de détection, respectivement. Si l’antigène est présent en solution, il reliera les deux ensembles de perles, générant un nouveau complexe perle-perle, qui lévitera entre les rangées de perles recouvertes d’anticorps. Une concentration accrue de l’antigène cible en solution générera un plus grand nombre de complexes perles-billes par rapport à des concentrations plus faibles d’antigène, permettant ainsi des mesures quantitatives de l’antigène cible. La lévitation magnétique est avantageuse pour d’autres méthodes en raison de son temps de préparation des échantillons réduit et de son manque de dépendance aux méthodes de lecture classiques. L’image générée est facilement capturée et analysée à l’aide d’un microscope standard ou d’un appareil mobile, tel qu’un smartphone ou une tablette.

Introduction

La lévitation magnétique est une technique développée pour séparer, analyser et identifier les types de cellules^1,2,3,protéines^4,5 et opioïdes⁶ en fonction uniquement de leur densité spécifique et de leurs propriétés paramagnétiques. La densité cellulaire est une propriété intrinsèque unique de chaque type de cellule directement liée à son taux métabolique et à son statut de différenciation^{7,8,9,10,11,12,13,14}. La quantification des changements subtils et transitoires de la densité cellulaire dans des conditions d’état d’équilibre et au cours de divers processus cellulaires pourrait permettre de mieux comprendre la physiologie et la physiopathologie cellulaires. Les changements de densité cellulaire sont associés à la différenciation cellulaire^15,16, la progression du cycle cellulaire^9,17,18,19, l’apoptose^20,21,22,23, et la transformation maligne^24,25,26 . Par conséquent, la quantification de changements spécifiques dans la densité cellulaire peut être utilisée pour différencier les cellules de différents types, ainsi que pour discriminer le même type de cellules subissant divers processus d’activation. Cela permet des expériences qui ciblent une sous-population cellulaire particulière, où les changements dynamiques de densité servent d’indicateur d’altération du métabolisme cellulaire²⁷. Comme il a été établi qu’une cellule peut altérer sa densité en réponse à un environnement changeant^7,il est impératif de mesurer la cinétique de la cellule par rapport à sa densité pour la comprendre pleinement, ce que les méthodes actuelles peuvent ne pas fournir¹². La lévitation magnétique, quant à elle, permet une évaluation dynamique des cellules et de leurs propriétés²⁸.

Les cellules sont diamagnétiques, ce qui signifie qu’elles n’ont pas de moment dipolaire magnétique permanent. Cependant, lorsqu’il est exposé à un champ magnétique externe, un faible moment dipolaire magnétique est généré dans les cellules, dans la direction opposée du champ appliqué. Ainsi, si les cellules sont suspendues dans une solution paramagnétique et exposées à un fort champ magnétique vertical, elles léviteront loin de la source magnétique et s’arrêteront à une hauteur, qui dépend principalement de leur densité individuelle. La lévitation diamagnétique d’un objet confiné au minimum d’un champ magnétique inhomogène est possible lorsque les deux critères suivants sont remplis : 1) la susceptibilité magnétique de la particule doit être inférieure à celle du milieu environnant, et 2) la force magnétique doit être suffisamment forte pour contrebalancer la force de flottabilité de la particule. Les deux critères peuvent être remplis en suspendant les globules bouclés dans un tampon magnétique et en créant de forts gradients de champ magnétique avec de petits aimants permanents peu coûteux et disponibles dans le commerce¹. La position d’équilibre d’une particule piégée magnétiquement sur un axe le long de la direction de la gravité est déterminée par sa densité (par rapport à la densité du tampon), sa susceptibilité magnétique (par rapport à la susceptibilité magnétique du tampon) et la signature du champ magnétique appliqué. Comme la densité et les propriétés magnétiques de la solution sont constantes dans tout le système, les propriétés de densité intrinsèque des cellules seront le principal facteur déterminant la hauteur de lévitation des cellules, les cellules plus denses lévitant moins que les cellules moins denses. Cette approche utilise un ensemble de deux billes de référence de densité (1,05 et 1,2 g/mL) qui nous permettent d’utiliser une analyse ratiométrique précise pour les mesures de densité. La modification de la concentration de la solution magnétique permet d’isoler différentes populations cellulaires, telles que les globules rouges des globules blancs, car la densité des cellules circulantes est spécifique à la cellule, éliminant ainsi le besoin de protocoles d’isolement ou d’autres manipulations cellulaires.

La majorité des méthodes de détection utilisées dans la recherche en biologie reposent sur l’extrapolation d’événements de liaison spécifiques en signaux linéaires faciles à quantifier. Ces méthodes de lecture sont souvent complexes et impliquent un équipement spécialisé et un personnel scientifique dédié. Une approche visant à la détection d’antigènes présents soit sur la membrane plasmique de cellules ou de vésicules extracellulaires, soit solubles dans le plasma, à l’aide d’une ou deux billes recouvertes d’anticorps, est décrite ici. Les perles doivent être de densités différentes les unes des autres et de celles des cibles interrogées. La présence de l’antigène cible dans un biofluide donné se traduit par un changement spécifique et mesurable de la hauteur de lévitation d’une cellule antigène positif liée à une bille de détection. Dans le cas d’antigènes solubles ou de vésicules extracellulaires, ils sont liés à la fois aux perles de capture et de détection, formant un complexe perle-perle plutôt qu’un complexe perle-cellule. Le changement de hauteur de lévitation dépend de la nouvelle densité des complexes perles-cellules ou perles-perles. Outre la modification de la hauteur de lévitation des complexes, qui indique la présence d’antigène dans le biofluide, le nombre de complexes dépend également de la quantité de cible, ce qui fait de la lévitation magnétique également une approche quantitative pour la détection d’antigènes²⁴.

Protocol

Le protocole expérimental utilisé dans cette étude a été approuvé par le Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB). 1. Configuration de l’instrument REMARQUE: L’imagerie des cellules en lévitation nécessite que deux aimants en néodyme de terres rares magnétisés sur l’axe z soient placés avec le même pôle face à l’autre pour générer un champ magnétique. La distance entre les aimants peut être personnalisée en fonc…

Representative Results

La lévitation magnétique concentre des objets de différentes densités à différentes hauteurs de lévitation en fonction de la densité de l’objet, de sa signature magnétique, de la concentration de solution paramagnétique et de la force du champ magnétique créé par deux aimants puissants de terres rares. Comme les deux aimants sont placés l’un sur l’autre, les échantillons en lévitation ne peuvent être vus, tout en maintenant l’éclairage de Köhler, qu’à l’aide d’un microscope tourné sur l…

Discussion

La centrifugation par gradient est actuellement la technique standard pour isoler les composants subcellulaires en fonction de leurs densités uniques. Cette approche nécessite toutefois l’utilisation de milieux de gradient spécialisés ainsi que d’équipements de centrifugeuse. L’approche de lévitation magnétique présentée ici permet une étude détaillée des propriétés morphologiques et fonctionnelles des cellules circulantes, avec un minimum, voire aucune manipulation des cellules, fournissant un accès…

Materials

2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate	Sigma Aldrich	M-2933	(MES); component of activation buffer
50×2.5×1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness	K&J Magnetics	Custom	Magnets used for the magnetic levitation device
Capillary Tube Sealant (Critoseal)	Leica Microsystems	267620	Used to cap the ends of the capillary tubes
Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)	Sigma Aldrich	CLS8163	Used to wash beads
Compact Lab Jack	Thorlabs	LJ750	Used for adjusting the magnetic levitation device
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	Solution for bead suspensions
Ethanolamine	Sigma Aldrich	E9508-100ML	Used during a wash step for beads
Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)	Invitrogen	C37608	Used to stain Rh+ cells
Gadoteridol Injection	ProHance	NDC 0270-1111-03	Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells
HBSS++	Gibco	14025-092	Solution for sample preparation
Human C5b,6 complex	Complement Technology, Inc	A122	Used to generate RBC Evs
Human C7 protein	Complement Technology, Inc	A124	Used to generate RBC Evs
Human C8 protein	Complement Technology, Inc	A125	Used to generate RBC Evs
Human C9 protein	Complement Technology, Inc	A126	Used to generate RBC Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	Used to secure magnetic levitation device to lab jacks
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC); used in antibody coupling reaction
Normal Rabbit IgG Control	R&D Systems	AB-105-C	Used to coat beads as a control condition
Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)	Boston Bioproducts	BM-220	Component of coupling buffer, used for washing steps
Polysorbate 20 (Tween 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	Component of activation buffer
Polystyrene Carboxyl Polymer	Bangs Laboratories	PC06004	Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling
Rabbit RhD Polyclonal Antibody	Invitrogen	PA5-112694	Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells
Research Grade Microscope	Olympus	Provis AX-70	Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells
Rubber Dampening Feet	Thorlabs	RDF1	Used to support the breadboard table
Square Boro Tubing	VitroTubes	8100-050	Capillary tube used for loading sample into Maglev
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	Used in antibody coupling reaction
Translational Stage	Thorlabs	PT1	Used for focusing and for scanning capillary tube