Recolección de tejidos y extracción de ARN de la articulación de la rodilla osteoartrítica humana

Resumen

Los tejidos primarios obtenidos de pacientes después de la artroplastia total de rodilla proporcionan un modelo experimental para la investigación de la osteoartritis con la máxima traducibilidad clínica. Este protocolo describe cómo identificar, procesar y aislar el ARN de siete tejidos únicos de la rodilla para apoyar la investigación mecanicista en la osteoartritis humana.

Resumen

La osteoartritis (OA) es una enfermedad articular crónica y degenerativa que afecta con mayor frecuencia a la rodilla. Como actualmente no hay cura, la artroplastia total de rodilla (ATC) es una intervención quirúrgica común. Los experimentos con tejidos primarios de OA humana obtenidos de TKA proporcionan la capacidad de investigar los mecanismos de la enfermedad ex vivo. Si bien anteriormente se pensaba que la OA afectaba principalmente al cartílago, ahora se sabe que afecta a múltiples tejidos de la articulación. Este protocolo describe la selección del paciente, el procesamiento de muestras, la homogeneización de tejidos, la extracción de ARN y el control de calidad (basado en la pureza, integridad y rendimiento del ARN) de cada uno de los siete tejidos únicos para apoyar la investigación del mecanismo de la enfermedad en la articulación de la rodilla. Con consentimiento informado, se obtuvieron muestras de pacientes sometidos a ATC para OA. Los tejidos se diseccionaron, lavaron y almacenaron dentro de las 4 h posteriores a la cirugía mediante congelación instantánea para la fijación de ARN o formalina para histología. Los tejidos recolectados incluyeron cartílago articular, hueso subcondral, menisco, almohadilla de grasa infrapatelar, ligamento cruzado anterior, sinovial y músculo oblicuo vasto medialis. Se probaron protocolos de extracción de ARN para cada tipo de tejido. La modificación más significativa involucró el método de desintegración utilizado para tejidos duros de células bajas, de matriz alta (considerados como cartílago, hueso y menisco) versus tejidos blandos de células relativamente altas, de matriz baja (considerados como almohadilla de grasa, ligamento, sinovial y músculo). Se encontró que la pulverización era apropiada para los tejidos duros, y la homogeneización era apropiada para los tejidos blandos. Se observó una proclividad de algunos sujetos a producir valores de número de integridad de ARN (RIN) más altos que otros sujetos consistentemente en múltiples tejidos, lo que sugiere que factores subyacentes como la gravedad de la enfermedad pueden afectar la calidad del ARN. La capacidad de aislar ARN de alta calidad de tejidos primarios de OA humana proporciona un modelo fisiológicamente relevante para experimentos sofisticados de expresión génica, incluida la secuenciación, que pueden conducir a conocimientos clínicos que se traducen más fácilmente a los pacientes.

Introducción

La rodilla es la articulación sinovial más grande del cuerpo humano, que comprende la articulación tibiofemoral entre la tibia y el fémur y la articulación patelofemoral entre la rótula y el fémur¹. Los huesos de la rodilla están revestidos con cartílago articular y soportados por varios tejidos conectivos, incluidos meniscos, grasa, ligamentos y músculos, y una membrana sinovial encapsula toda la articulación para crear una cavidad llena de líquido sinovial^1,2,3 (Figura 1). Una rodilla sana funciona como una articulación ....

Protocolo

Este protocolo de estudio fue aprobado y siguió las pautas institucionales establecidas por la Junta de Revisión Institucional del Sistema de Salud Henry Ford (IRB # 13995).

1. Selección de pacientes

1. Identifique a los pacientes de entre los programados para someterse a TKA con un cirujano ortopédico.
2. Seleccionar a los pacientes en función de los criterios de elegibilidad definidos por el protocolo del estudio. Ejemplos de criterios de inclusión incluyen tener 18 años de edad o más y tener un diagnóstico confirmado de osteoartritis de rodilla. Los ejemplos de criterios de exclusión incluyen someterse a un reemplazo parcia....

Resultados

Siete tejidos únicos de la articulación de la rodilla humana están disponibles para su recolección de pacientes sometidos a ATC para OA(Figura 1). En este protocolo, cada uno de estos tejidos fue identificado y procesado dentro de las 4 h de la extirpación quirúrgica (Figura 2). Siguiendo los pasos descritos en la Figura 3,las porciones de cada tejido se fijaron en formalina para la evaluación histológica(Figura.......

Discusión

El protocolo presentado ha demostrado ser exitoso para la recolección de siete tejidos primarios de OA humana para la extracción de ARN(Tabla 1)y el procesamiento histológico(Figura 4). Antes de recolectar muestras de pacientes, es necesario establecer un protocolo aprobado por el IRB, idealmente en colaboración con un cirujano o equipo quirúrgico. La aplicación de un protocolo estandarizado para la recolección de muestras (por ejemplo, la resección desde ubicaciones in .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Eppendorf	05 402	Estériles, sin nucleasas. Reservado solo para el trabajo de ARN.
10% Formalina	Cardinal Health	C4320-101	Almacene en un gabinete químico cuando no esté en uso.
100% cloroformo (grado de biología molecular)	Fisher Scientific	ICN19400290	estéril, sin nucleasas. Reservado solo para el trabajo de ARN, guárdelo en el gabinete químico cuando no esté en uso.
100% Etanol (Grado de Biología Molecular)	Fisher Scientific	BP2818500	Estéril, libre de nucleasas. Reservado solo para el trabajo de ARN, cuando se diluya use agua sin DEPC/nucleasa.
100% Isopropanol (Grado de Biología Molecular)	Fisher Scientific	AC327272500	Estéril, libre de nucleasas. Reservado solo para el trabajo de ARN, guárdelo en el gabinete químico cuando no esté en uso.
100% Reactivo Alcohol	Cardinal Health	C4305	Diluido al 70% con dH2O para fines de limpieza.
Placas de cultivo estériles de 15 cm	Thermo Scientific	12-556-003	Estériles, sin nucleasas.
15 mL tubos de polipropileno (Falcon)	Fisher Scientific	14 959 53A	Estériles, sin nucleasas.
2 mL de crioviales (roscados externamente)	Fisher Scientific	10 500 26	Estériles, sin nucleasas.
Tubos de fondo redondo de 5 mL Corning		352052	Estéril, sin nucleasas. Reservado solo para el trabajo de ARN.
50 mL tubos de polipropileno (Falcon)	Fisher Scientific	12 565 271	Estériles, sin nucleasas.
Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Para la medición de la integridad del ARN.
Gabinete de bioseguridad Equipo			general de laboratorio
Cortadores de huesos	Fisher Scientific	08 990	Esterilizado con 70% de EtOH.
Campana de gases químicos Equipo	general de
Bisturíes desechables (n.º 10)	Thermo Scientific	3120032	Estéril, sin nucleasas.
EDTA	Life Technologies	15-576-028	Solución al 10% con dH2O.
Pinzas	Cualquier proveedor		esterilizado con 70% de EtOH.
Glycoblue Coprecipitant	Fisher Scientific	AM9516	Reservado solo para el trabajo de ARN, almacene a -20 °C.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Nitrógeno líquido	Cualquier proveedor
Nitrógeno líquido Dewar	Equipo
Mortero y mortero	Cualquier proveedor		Reservado solo para trabajo de ARN, esterilizado según protocolo.
Espectrofotómetro Nanodrop	Thermo Scientific	ND-2000	Para mediciones de pureza y rendimiento de ARN.
Agua sin nucleasas/tratada con DEPC	Fisher Scientific		Estéril, sin nucleasas. Reservado solo para el trabajo de ARN.
PBS (Estéril)	Gibco	20 012 050	Estéril, sin nucleasas.
Pipetas (2 y micro; L, 20 y micro; L, 200 y micro; L, 1000 y micro; L) & consejos	Cualquier proveedor		Estéril, sin nucleasas.
Plasma/Suero Kit avanzado de miARN	Qiagen	217204
Centrífuga refrigerada 5810R	Eppendorf	22625101
RNAlater	Thermo Scientific	50 197 8158	Estéril, sin nucleasas.
RNAse Away/RNAseZap	Fisher Scientific	7002
Espátula (tamaño semimicro)	Cualquier proveedor		Reservado solo para trabajos de ARN.
Homogeneizador de tejidos	Pro Scientific	01-01200	Reservado solo para el trabajo con ARN, esterilizado según protocolo.
Reactivo TRIzol	Fisher Scientific	15 596 026	Estéril, sin nucleasas. Reservado solo para el trabajo de ARN.

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