この研究は、クローニングや生きている細胞を使用せずに、合成遺伝子断片からタンパク質スクリーニングキャンペーンのための大量(μg-mg)量のDNAを作成するためのプロトコルを記述しています。最小のテンプレートは酵素的に消化され、円形化され、等熱転がり円増幅を使用して増幅される。無細胞発現反応は、非精製物で行うことができる。
このプロトコルは、最小DNAテンプレートの設計と酵素増幅のステップを説明し、無細胞発現を用いて24時間未満でアッセイ可能タンパク質の迅速なプロトタイピングを可能にする。ベンダーからDNAを受け取った後、遺伝子断片はPCR増幅、切断、円形化、およびクライオバンクされる。少量のバンクDNAは、等温転環増幅(RCA)を使用して、希釈され、有意に増幅されます(最大106x)。RCAは、出発物質のピコグラムレベル(すべての開始合成フラグメントが使用されている場合はmgレベル)から最小発現テンプレートのマイクログラム量を得ることができます。この作業では、20 pgの開始量は最終製品の4 μgをもたらしました。得られたRCA製品(最小鋳型の連結物)を、精製工程なしで無細胞反応に直接添加することができる。この方法は完全にPCRベースであるため、自動液体処理システムと組み合わせることで、将来のハイスループットスクリーニングの取り組みが可能になる可能性があります。
無細胞遺伝子発現(CFE)は、多くの用途を備えた強力なツールとして登場しました。このような用途には、疾患検出1、2、3、4、5、6、微量栄養素および小分子検出7、8、9、10、11、12、バイオマニュファクチャリング13、14、15、16、17が含まれます。 ,18, 教育19,20,21, 製造難しいタンパク質17,22,23,24,25,26,27, およびバリアントスクリーニング23,28,29,30,32 、33.これは、無細胞システムの開放性と柔軟性が与えるためです。多くの偉大なレビュー記事は、技術上の歴史的教育と将来の展望を提供しています34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44.
典型的な無細胞反応は、細胞抽出物、エネルギーミックス、および遺伝的テンプレートの3つの主要な成分で構成されています。アクティブセル抽出物には、転写と翻訳(TXTL)に必要なすべての機械が含まれ、さまざまな方法で処理することができます36.解糖性中間体、電解質、アミノ酸、およびエネルギーミックスの補因子は、TXTLプロセスをサポートします。これは、無細胞実験45における変動の主要な源であり、多くの方法で34、46を調製することができる。遺伝的テンプレートの調製は、従来のクローニング法が優れた発現特性を有するプラスミドをもたらすため、改善が少なくなっています。これらの伝統的な方法の欠点は、それらを構築し、伝播するために必要な生物学的専門知識のターンアラウンドタイムと量です。最近の最適化の取り組みにより、エネルギーミックス調製49,50と並行して行うことができる細胞抽出製剤47,48の簡単な24時間のワークフローが生まれている。ただし、従来のクローニングは CFE プロトタイピングのタイムラインに複数の日を追加します (表 1)23.市販遺伝子断片から迅速に増幅されたPCR産物は直接51を使用できますが、約5つの反応(従来の15μL量)に相当するDNAの1μgしか生成されていないため、試作実験の数が制限されます。これらの追加の循環化と等温増幅のステップにより、DNAのミリグラム量より大きい(1mgの5,000反応以上)が可能です。これは、タンパク質または組み合わせ酵素ネットワーク(無細胞代謝工学)のハイスループットスクリーニングで行うことができるテストの数を劇的に増加させます。また、高濃度DNAとして線形テンプレートライブラリを効果的に保存することができます。さらに、材料科学の用途(タンパク質ベースの繊維およびヒドロゲル)に必要な大量のタンパク質を試作するために、テンプレートの量を増やす必要があります。線形テンプレートのいくつかの制限は、BL21 DE3 Starからの抽出物を使用するか、最近発見された方法を使用して、リニアテンプレートを劣化52、53、54から保護することで克服できます。しかし、これは、PCR増幅のためのベンダー製DNAの在庫が限られているか、クローン作成に必要な生物学的専門知識と機器の問題を持つことに対処していません。
この研究は、少量のベンダー生産遺伝子断片(通常は500〜1000ngの凍結乾燥粉末)から得ることができる発現テンプレートの量を増やすために明示的に設計されたプロトコルを提示する。記載された方法は、プラスミドでの伝統的なクローニングを行ったり、生きている細胞での変換および伝播を行うために必要なスキルを必要としない。メールで遺伝子断片を受信すると、ユーザは等温転環増幅(RCA)を採用することにより、多くの無細胞反応のための十分なテンプレートを生成することができる(図1)23。ベンダーから受け取ったDNAの量は限られたスクリーニング努力に十分かもしれませんが、すぐに枯渇し、遺伝子断片の再購入には時間とコストがかかります。この方法は、特に毒性があり、大腸菌でクローンを作成することが困難な遺伝子に適しています。
目的の遺伝子は任意の所望のタンパク質であり得るが、この方法の新しい採用者のためのウェルプレートリーダー上のリアルタイムまたはエンドポイント読み出しのための便利なレポーターとして蛍光タンパク質から始めることをお勧めします。新しいタンパク質配列については、所望のタンパク質のアミノ酸配列をコピーし、所望のコドン最適化ツール61,62<sup clas…
The authors have nothing to disclose.
著者らは、このプロジェクトの部分的な支援に関するNIH 1R35GM138265-01およびNSF 2029532を認めている。
Alaline | Formedium | DOC0102 | |
Ammonium glutamate | MP Biomedicals | MP21805951 | |
Arginine | Formedium | DOC0106 | |
Asparagine | Formedium | DOC0114 | |
Aspartic Acid | Formedium | DOC0118 | |
ATP | Sigma | A2383 | |
Axygen Sealing Film | Corning | PCR-SP | |
CMP | Sigma | C1006 | |
Coenzyme A | Sigma | C3144 | |
CutSmart Buffer | NEB | B7204S | Provided with HindIII |
Cysteine | Formedium | DOC0122 | |
DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | D4004 | Used for purifying DNA |
dNTPs | NEB | N0447 | |
E. coli tRNA | Sigma (Roche) | 10109541001 | |
Folinic Acid | Sigma | 47612 | |
Gene Fragment | IDT | ||
Glutamic Acid | Formedium | DOC0134 | |
Glutamine | Formedium | DOC0130 | |
Glycine | Formedium | DOC0138 | |
GMP | Sigma | G8377 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
HindIII-HF | NEB | R3104L | |
Histidine | Formedium | DOC0142 | |
Isoleucine | Formedium | DOC0150 | |
Leucine | Formedium | DOC0154 | |
Lysine | Formedium | DOC0158 | |
Magnesium glutamate | Sigma | 49605 | |
Methionine | Formedium | DOC0166 | |
Microtiter Plate (384 well) | Greiner | 781906 | |
Microtiter Plate (96 well) | Greiner | 655809 | |
Multimode Plate Reader | BioTek | Synergy Neo2 | |
NAD | Sigma | N8535 | |
NanoPhotometer | Implen | NP80 | |
OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480 | |
PCR Tube | VWR | 20170-012 | |
Phenylalanine | Formedium | DOC0170 | |
Phosphoenolpyruvate | Sigma (Roche) | 10108294 | |
Potassium glutamate | Sigma | G1501 | |
Potassium oxalate | Fisher Scientific | P273 | |
Proline | Formedium | DOC0174 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Serine | Formedium | DOC0178 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with T4 DNA Ligase |
TempliPhi Amplification Kit | Cytiva | 25640010 | Used for RCA |
Thermal Cycler | Biorad | C1000 Touch | |
Thermoblock | Eppendorf | ThermoMixer FP | |
Threonine | Formedium | DOC0182 | |
Tryptophan | Formedium | DOC0186 | |
Tyrosine | Formedium | DOC0190 | |
UMP | Sigma | U6375 | |
Valine | Formedium | DOC0194 |