Etikettering van extracellulaire blaasjes voor het monitoren van migratie en opname in kraakbeenexplantaten
Summary
Hier presenteren we een protocol om van bloedplaatjes lysaat afgeleide extracellulaire blaasjes te labelen om hun migratie en opname in kraakbeenexplantaten te volgen die worden gebruikt als een model voor artrose.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EV’s) worden in verschillende onderzoeken gebruikt om hun potentieel als celvrije behandeling te bewijzen vanwege hun lading afgeleid van hun cellulaire bron, zoals bloedplaatjeslysaat (PL). Bij gebruik als behandeling wordt verwacht dat EV’s de doelcellen binnendringen en een reactie hiervan bewerkstelligen. In dit onderzoek zijn PL-afgeleide EV’s bestudeerd als een celvrije behandeling voor artrose (OA). Zo werd een methode opgezet om EV’s te labelen en hun opname op kraakbeenexplantaten te testen. PL-afgeleide EV’s worden gelabeld met de lipofiele kleurstof PKH26, tweemaal door een kolom gewassen en vervolgens getest in een in vitro ontstekingsgestuurd OA-model gedurende 5 uur na deeltjeskwantificering door nanodeeltjesvolganalyse (NTA). Elk uur worden kraakbeenexplantaten gefixeerd, geparaffined, in secties van 6 μm gesneden om op dia’s te monteren en waargenomen onder een confocale microscoop. Dit maakt het mogelijk om te verifiëren of EV’s tijdens deze periode de doelcellen (chondrocyten) binnendringen en hun directe effect analyseren.
Introduction
Artrose (OA) is een articulaire degeneratieve ziekte die een progressieve en onomkeerbare ontsteking en vernietiging van de extracellulaire matrix van het gewrichtskraakbeen impliceert1. Hoewel verschillende vormen van artritis tal van behandelingenhebben 2,3,4,worden deze beperkt door hun bijwerkingen en beperkte werkzaamheid. Tissue engineering technieken met behulp van autologe chondrocyten implantatie worden routinematig toegepast voor de regeneratieve behandeling van gewond kraakbeen in vroege OA kraakbeen laesies4. Celgebaseerde therapieën zijn voornamelijk beperkt vanwege het beperkte aantal fenotypisch stabiele chondrocyten of chondroprogenitors die in staat zijn om het kraakbeen effectief te repareren3. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën om ziekteprogressie te voorkomen en grote kraakbeenlaesies te regenereren van het grootste belang.
Extracellulaire blaasjes (EV’s) zijn voorgesteld als een behandeling voor artrose door verschillende auteurs5,6. EV’s zijn vliezige lichamen die door de meerderheid van de celtypen worden uitgescheiden, zijn betrokken bij intercellulaire signalering en er is aangetoond dat ze de therapeutische effecten van stamcellen uitoefenen7,8,9, waardoor ze onlangs interesse hebben gewekt in regeneratieve geneeskunde10. EV’s afgeleid van mesenchymale stromale cellen (MSC’s) zijn de belangrijkste therapeutische EV’s die zijn onderzocht voor artrose, hoewel andere gewrichtsgerelateerde cellen zijn gebruikt als EV-bronnen, bijvoorbeeld chondroprogenitors of immuuncellen11,12.
Bloedplaatjesconcentraten, zoals bloedplaatjeslysaten (PR’s), worden gebruikt om de wondgenezing bij verschillende verwondingen te verbeteren, zoals hoornvlieszweren13,14,15 of bij peesweefselregeneratie16, vanwege de hypothese dat de EV-component van bloedplaatjesconcentraten verantwoordelijk kan zijn voor deze effecten17 . Sommige studies met betrekking tot gewrichtsgerelateerde ziekten gebruiken van bloedplaatjes afgeleide EV’s (PL-EV’s) als een behandeling om artroseaandoeningen te verbeteren. PL-EV’s verbeteren de proliferatie en celmigratie van chondrocyten door de Wnt/β-catenineroute18te activeren, de expressie van chondrogene markers in artrose chondrocyten19te bevorderen of hogere niveaus van chondrogene eiwitten en minder tissulaire afwijkingen te vertonen bij artrosekonijnen die worden behandeld met PL-EV’s18.
EV’s bevatten eiwitten, lipiden en nucleïnezuren die vrijkomen in de doelcel, waardoor cel-tot-cel communicatie tot stand wordt gebracht, wat het belangrijkste kenmerk is met betrekking tot hun therapeutische toepassingen20. De effecten van EV’s zijn afhankelijk van hun bereikcellen en de daaropvolgende ladingafgifte. Dit effect kan indirect worden bevestigd door veranderingen in cellen, zoals metabole activiteit of genexpressiemodificatie. Deze methoden laten echter niet toe om te visualiseren hoe EV’s cellen bereiken om hun functie uit te oefenen. Dit artikel presenteert dus een methode om deze PL-afgeleide EV’s te labelen om te worden gebruikt als een behandeling voor ontstekingsgedreven OA-kraakbeenexplantaten. Confocale microscopie werd gebruikt om de EV-opname en progressie naar de chondrocyten in de explantaten te volgen in een time-lapse van 5 uur.
Protocol
Representative Results
Discussion
EV-beeldvorming helpt om EV-eigenschappen te begrijpen, zoals hun afgifte- en opnamemechanismen. Hun beeldvorming maakt het mogelijk om hun biodistributie te monitoren en hun farmacokinetische eigenschappen te karakteriseren als medicijnvoertuigen. EV-beeldvorming en -tracking kunnen echter moeilijk zijn vanwege hun kleine afmetingen, hoewel veel beeldvormingsapparaten en etiketteringstechnieken zijn ontwikkeld om onderzoekers te helpen EV’s te volgen onder in vitro es in vivo omstandigheden<sup class="…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, medegefinancierd door het ESF Europees Sociaal Fonds en het EFRO Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (MS16/00124; CP16/00124); door het PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), gefinancierd door de duurzame toeristenbelasting van de Balearen; van de Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); door het POSTDOCTORALE PROGRAMMA FOLIUM (FOLIUM 17/01) binnen de FUTURMed, gefinancierd voor 50% door de belasting op duurzaam toerisme van de Balearen en voor 50% door het ESF; en door de Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).
Materials
| Material | |||
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1 mL Syringe BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Prepared at 20% with Milli-Q water |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolute ethanol Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water |
| Biopsy Punch with plunger 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Prepared at 5% with PBS |
| Cartilage explants | IdISBa Biobank | ||
| Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| Cover glass 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Embedded paraffin tissue blocks | IdISBa Biobank | Fee for service | |
| Exo-spin mini-HD columns | Cell guidance systems | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 and Dliuent C included |
| Sodium citrate dihydrate | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNFα | R&D systems | 210-TA-005 | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | A78100101 | |
| TCS-SPE confocal microscope | Leica Microsystems | 5200000271 |
Referencias
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, &. #. 3. 2. 1. ;., Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
- Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Burke, J., et al. et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
- Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
- Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
- Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- D’Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).
- Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
- El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
- Yuta, K., et al. Graefe’s archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
- Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31, 289-292 (2007).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
- Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).
- Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).
- Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
- Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).
- de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
- Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
- Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
- Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
- Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021)
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
- Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).
