转变生长因子的分析 - 家族产品分泌到 异种胚胎 的爆炸
Summary
当转化生长因子 +家族前体蛋白在 Xenopus laevis 胚胎中异位表达时，它们变暗、裂开并分泌到从晚期到早期胃肠阶段的胚芽。我们描述了一种从气穴中吸气产品的方法，用于免疫腹腔分析。
Abstract
以Tgfí/Nodal或骨形态遗传蛋白（Bmp）配体为代表的转化生长因子+（Tgf+）超级家庭的两只手臂分别在胚胎发育和成人平衡中起着至关重要的作用。Tgf í 家族的成员被制成不活跃的前体，在内质视网膜内变暗并折叠。前体随后被切成配体和前列体碎片。虽然只有二元配体可以与Tgfí受体接触并激活下游信号，但人们越来越认识到，原体的浮躁有助于配体活动。本文描述了一个协议，可用于识别在激活 Tgf+ 前体蛋白质期间产生的产品。RNA编码Tgf+前体首先微注射到 X.莱维斯 胚胎中。第二天，产品从胃肠阶段胚胎的胚芽中采集，并在西方的斑点上进行分析。此协议可以相对较快地完成，不需要昂贵的试剂，并在生理条件下提供浓缩 Tgf + 产品的来源。
Introduction
转化生长因子 +（Tgf í） 超级家庭的成员被合成为非活性、变暗的前体蛋白质。然后，前体由蛋白转化酶 （PC） 家族的成员切割，无论是在分泌途径内还是在细胞外。这创造了一个活跃的，脱硫粘结的配体二元和两个前列蛋白片段1。虽然30多年来人们一直知道，Tgfí家族前体的前列质需要产生一个活跃的配体2，但关于前列质如何促进配体功能的理解是不完整的。
虽然对Tgfí家庭成员的蛋白解激活过程的理解仍然不完整，但人们越来越有兴趣了解哪些 PC 共识主题在体内被切开，是否发生在特定的细胞外或细胞外隔间，以及亲体是否与裂开的配体3有共性或非共性联系。多项研究表明，前列腺素不仅能引导4 、 5前配体折叠，还能影响生长因子稳定性和作用范围6 、 7 、 8 、 9 ，驱动同质体或异质体10的形成，将配体锚定在细胞外基质中，以维持配体延迟11 ，在某些情况下，作为配体的功能本身的权利激活异质性 信号12.Tgfí家族许多成员的前列肌内的异质性突变与人类的眼睛、骨骼、肾脏、骨骼或其他缺陷有关。这些发现突出了前列膜在产生和维持活性配体方面的关键作用，并强调了识别和破译 Tgf+ 家族前体蛋白解成熟期间开发的产品的作用的重要性。
在这里，我们描述了一个详细的协议，用于吸入在 Tgf 1 家族前体成熟期间产生的产品，这些前体来自X . laevis胚胎的胚芽，然后在免疫膨胀上分析它们。此协议可用于确定前体蛋白质中的一个或多个 PC 共识主题是否在体内10、13中裂开，确定切开每个主题的内源 PC （s）13，14、比较Tgf+家族同质体与异质体10的体内形成，或分析Tgf+前体中人类疾病相关点突变是否影响其形成功能性二元配体的能力。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的协议的主要优点是，它可以相对较快地完成，不需要昂贵的试剂，并提供在生理条件下浓缩Tgfí产品的来源。另一个优点是，它允许人们分析表位标记的蛋白质，从而规避缺乏商业上可用的抗体，识别大多数Tgfí家族前列腺素。虽然也可以分析转染培养哺乳动物细胞中表位标记的 Tgf+ 前体蛋白的，但使用X . laevis有几个优点。早期X.laevis胚胎表达所有四个成员的PC家族是内源?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢玛丽·桑切斯对动物的出色照顾。作者的研究得到了国家卫生研究院国家儿童健康与人类发展研究所（NIH/NICHD）的资助，该研究所提供R01HD067473-08和R21 HD102668-01，国家糖尿病和消化和肾脏疾病研究所（NIDDK/NIH）授予R01DK128068-01。
Materials
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C79-500 | |
| Calcium Nitrate | Fisher | C109-500 | |
| Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glass capillary, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injection Syringe, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Needle, 26 G | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette Puller | Narashige | PC-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membrane | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S271-10 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
Referencias
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