Gebruiksvriendelijke, high-throughput en volledig geautomatiseerde data-acquisitie software voor cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje
Summary
Cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje vereist een geschikt softwarepakket en een gebruiksvriendelijke pijplijn voor automatische data-acquisitie met hoge doorvoer. Hier presenteren we de toepassing van een volledig geautomatiseerd softwarepakket voor beeldacquisitie, Latitude-S, en een praktische pijplijn voor het verzamelen van gegevens van verglaasde biomoleculen onder omstandigheden met een lage dosis.
Abstract
In de afgelopen jaren hebben technologische en methodologische ontwikkelingen in cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje (cryo-EM) een nieuwe weg vrijgemaakt voor de hoge-resolutie structuurbepaling van biologische macromoleculen. Ondanks de opmerkelijke vooruitgang in cryo-EM, is er nog steeds ruimte voor verbetering in verschillende aspecten van de single-particle analyse workflow. Single-particle analyse vereist een geschikt softwarepakket voor high-throughput automatische data-acquisitie. In de afgelopen acht jaar zijn verschillende softwarepakketten voor automatische data-acquisitie ontwikkeld voor automatische beeldvorming voor cryo-EM met één deeltje. Dit artikel presenteert een toepassing van een volledig geautomatiseerde beeldacquisitiepijplijn voor verglaasde biomoleculen onder omstandigheden met een lage dosis.
Het demonstreert een softwarepakket, dat cryo-EM-gegevens volledig, automatisch en nauwkeurig kan verzamelen. Bovendien worden verschillende microscopische parameters eenvoudig geregeld door dit softwarepakket. Dit protocol demonstreert het potentieel van dit softwarepakket in geautomatiseerde beeldvorming van het spike-eiwit severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) met een 200 keV cryo-elektronenmicroscoop uitgerust met een directe elektronendetector (DED). Ongeveer 3.000 cryo-EM-filmbeelden werden verkregen in een enkele sessie (48 uur) van gegevensverzameling, wat een atomaire resolutiestructuur van het spike-eiwit van SARS-CoV-2 opleverde. Bovendien geeft deze structurele studie aan dat het spike-eiwit twee belangrijke conformaties aanneemt, 1-RBD (receptor-bindend domein) open en alle RBD-down gesloten conformaties.
Introduction
Cryo-EM met één deeltje is een mainstream structurele biologietechniek geworden voor structuurbepaling met hoge resolutie van biologische macromoleculen1. Reconstructie van één deeltje is afhankelijk van het verkrijgen van een groot aantal microfoto’s van verglaasde monsters om tweedimensionale (2D) deeltjesbeelden te extraheren, die vervolgens worden gebruikt om een driedimensionale (3D) structuur van een biologisch macromolecuul te reconstrueren2,3. Vóór de ontwikkeling van DED’s varieerde de resolutie die werd bereikt met een reconstructie van één deeltje tussen 4 en 30 Å4,5. Onlangs is de haalbare resolutie van cryo-EM met één deeltje verder gegaan dan 1,8 Å6. DED en geautomatiseerde software voor gegevensverzameling hebben een belangrijke bijdrage geleverd aan deze resolutierevolutie7, waarbij menselijke tussenkomst voor gegevensverzameling minimaal is. Over het algemeen wordt cryo-EM-beeldvorming uitgevoerd met lage elektronendosissnelheden (20-100 e / Å2) om door elektronenbundels geïnduceerde stralingsschade van biologische monsters te minimaliseren, wat bijdraagt aan de lage signaal-ruisverhouding (SNR) in het beeld. Deze lage SNR belemmert de karakterisering van de hoge resolutie structuren van biologische macromoleculen met behulp van single-particle analyse.
De nieuwe generatie elektronendetectoren zijn CMOS-gebaseerde detectoren (complementary metal-oxide-semiconductor), die deze lage SNR-gerelateerde obstakels kunnen overwinnen. Deze CMOS-camera’s met directe detectie maken een snelle uitlezing van het signaal mogelijk, waardoor de camera bijdraagt aan een betere puntspreidingsfunctie, geschikte SNR en uitstekende detective quantum efficiency (DQE) voor biologische macromoleculen. Directe detectiecamera’s bieden een hoge SNR8 en weinig ruis in de opgenomen beelden, wat resulteert in een kwantitatieve toename van de detective quantum efficiency (DQE) – een maat voor hoeveel ruis een detector aan een afbeelding toevoegt. Deze camera’s nemen ook films op met een snelheid van honderden frames per seconde, wat snelle gegevensverzameling mogelijk maakt9,10. Al deze eigenschappen maken snelle directe detectiecamera’s geschikt voor toepassingen met een lage dosis.
Bewegingsgecorrigeerde stapelafbeeldingen worden gebruikt voor gegevensverwerking om 2D-classificatie te berekenen en een 3D-dichtheidskaart van macromoleculen te reconstrueren met behulp van verschillende softwarepakketten zoals RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 es EMAN215. Voor analyse van één deeltje is echter een enorme dataset nodig om een structuur met hoge resolutie te bereiken. Daarom zijn automatische tolheffingen voor gegevensverzameling zeer essentieel voor het verzamelen van gegevens. Om grote cryo-EM datasets vast te leggen, zijn de afgelopen tien jaar verschillende softwarepakketten gebruikt. Speciale softwarepakketten, zoals AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS en EPU, zijn ontwikkeld voor geautomatiseerde gegevensverzameling.
Deze softwarepakketten gebruiken routinetaken om automatisch gatposities te vinden door de afbeeldingen met lage vergroting te correleren met afbeeldingen met een hoge vergroting, wat helpt bij het identificeren van gaten met glasachtig ijs van geschikte ijsdikte voor beeldacquisitie onder omstandigheden met een lage dosis. Deze softwarepakketten hebben het aantal repetitieve taken verminderd en de doorvoer van de cryo-EM-gegevensverzameling verhoogd door gedurende meerdere dagen continu een enorme hoeveelheid gegevens van goede kwaliteit te verzamelen, zonder enige onderbreking en de fysieke aanwezigheid van de operator. Latitude-S is een vergelijkbaar softwarepakket, dat wordt gebruikt voor automatische gegevensverzameling voor analyse van één deeltje. Dit softwarepakket is echter alleen geschikt voor K2/K3 DED’s en wordt bij deze detectoren geleverd.
Dit protocol demonstreert het potentieel van Latitude-S in de geautomatiseerde beeldacquisitie van SARS-CoV-2 spike-eiwit met een directe elektronendetector uitgerust met een 200 keV cryo-EM (zie de tabel met materialen). Met behulp van deze tool voor gegevensverzameling worden automatisch 3.000 filmbestanden van SARS-CoV-2 spike-eiwit verkregen en wordt verdere gegevensverwerking uitgevoerd om een spike-eiwitstructuur met een resolutie van 3,9-4,4 Å te verkrijgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Latitude-S is een intuïtieve gebruikersinterface die een omgeving biedt om in twee dagen tijd automatisch duizenden microfoto’s of filmbestanden met hoge resolutie in te stellen en te verzamelen. Het biedt eenvoudige navigatie over de rasters en handhaaft de positie van de microscooptrap terwijl deze van lage vergroting naar hoge vergroting gaat. Elke stap van gegevensverzameling met Latitude-S is tijdbesparend, met functies zoals een eenvoudige gebruikersinterface, snelle streaming van gegevens met een snelheid tot 4,5…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen het Department of Biotechnology, het Department of Science and Technology (DST) and Science en het Ministry of Human Resource Development (MHRD), India, voor financiering en de cryo-EM-faciliteit in IISc-Bangalore. We erkennen het DBT-BUILDER-programma (BT / INF / 22 / SP22844 / 2017) en DST-FIST (SR / FST / LSII-039 / 2015) voor de nationale Cryo-EM-faciliteit in IISc, Bangalore. We erkennen financiële steun van de Science and Engineering Research Board (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 en SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). We bedanken mevrouw Ishika Pramanick voor het voorbereiden van cryo-EM-rasters, cryo-EM-gegevensverzameling en het voorbereiden van de tabel met materialen. We bedanken ook de heer Suman Mishra voor cryo-EM beeldverwerking en voor het helpen bij het voorbereiden van de cijfers. We bedanken Prof. Raghavan Varadarajan voor het helpen verkrijgen van het gezuiverde spike-eiwitmonster voor deze studie.
Materials
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
Referencias
- Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
- Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
- Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
- McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
- Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
- Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
- Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy – TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
- Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
- Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, 384-389 (2007).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
- Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
- Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
- Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
- Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
- Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
- Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).
