Este protocolo detalha um método para o isolamento de neutrófilos de sangue inteiro, casacos de buffy ou membranas de leucemia, alcançando bom rendimento, alta pureza e ativação celular mínima. Utilizamos purificação de gradiente, sedimentação de glóbulos vermelhos (RBC) e lise RBC para obter uma preparação de neutrófilo de alta qualidade/pureza.
Os neutrófilos (PMNs) são os leucócitos mais abundantes na circulação humana, variando de 40 a 70% do total de leucócitos sanguíneos. São as primeiras células recrutadas no local da inflamação através de extravasões rápidas através de vasos. Lá, os neutrófilos executam uma série de funções para matar patógenos invasores e mediar a sinalização imunológica. Neutrófilos recém-purificados do sangue humano são o modelo de escolha para o estudo, já que nenhuma linha celular replica totalmente as funções do PMN e a biologia. No entanto, os neutrófilos são células de curta duração, terminatavelmente diferenciadas e são altamente suscetíveis à ativação em resposta a estímulos físicos (temperatura, centrifugação) e biológicos (endotoxinas, quimioterapia e citocinas). Portanto, é crucial seguir um método padronizado, confiável e rápido para obter células puras e não ativadas. Este protocolo apresenta um protocolo atualizado combinando centrifugação de gradiente de densidade, sedimentação de glóbulos vermelhos (RBC) e lise RBC para obter alta pureza pmn e minimizar a ativação celular. Além disso, também são discutidos métodos para avaliar a qualidade, a viabilidade e a pureza do nêutrons.
O sistema imunológico inato é composto por muitos tipos de células que mantêm a homeostase imunológica e o desembaraço do patógeno, juntamente com muitas outras funções fisiológicas. Os neutrófilos compõem a maior poça de glóbulos brancos em circulação humana1. A maioria dos neutrófilos maduros são armazenados na medula óssea, que é o local de geração de novos neutrófilos, também chamados de granulopoiesis. Na medula óssea, os progenitores granulocitos saem do ciclo celular e se diferenciam terminalmente, adquirindo seus núcleos segmentados característicos e grânulos2. Sob condições inflamatórias, em resposta a quimiocinas, citocinas e padrões moleculares associados a danos e patogênicos, os neutrófilos são mobilizados da corrente sanguínea e da medula óssea para executar uma ampla gama de funções. Estes incluem secreção de citocinas, fagocitose direta do patógeno, liberação de espécies reativas de oxigênio, degranulação de proteínas antimicrobianas e formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos.
As moléculas usadas por neutrófilos para combater a infecção são tóxicas para os micróbios e para o hospedeiro. Assim, o tempo de vida e a remoção adequada de neutrófilos envelhecidos/moribundos são altamente regulados, e têm uma vida útil limitada em circulação (<48 h)3. Devido a essa curta sobrevida, o corpo humano produz, em média, 100 bilhões de novos neutrófilos todos os dias para manter a homeostasepopulacional 4. A granulopoiese de emergência pode aumentar ainda mais a liberação de neutrófilos, maduros e imaturos, no sangue durante inflamação e infecção5. A importância dos neutrófilos na resposta imune inata é destacada por pacientes com neutropenia adquirida ou congênita, suscetíveis a infecções bacterianas e fúngicas6.
Muitos desafios surgem ao estudar biologia neutrófila e seus papéis na resposta imune devido à sua natureza, incluindo sua curta sobrevivência e conteúdo citotóxico. As linhas celulares semelhantes a neutrófilos têm sido comumente diferenciadas das células de leucemia promieelocítica humana HL-60 e células PLB-9857,8. Embora possam exibir morfologia semelhante a neutrófilos e realizar quimotaxis, essas linhas celulares não podem recapitular totalmente a biologia dos neutrófilos. Ensaios in vitro usando essas linhas de célula também são incapazes de recapitular experimentos in vivo. Além disso, a diferenciação dessas células precisa ser induzida e pode ser afetada adversamente pela manipulação genética antes da diferenciação.
Recentemente, foram desenvolvidos métodos para contornar essas questões usando promotores induíveis para modular a expressão genética pós diferenciação nas células HL-609. Mesmo com essas ferramentas, pmns humanos primários são necessários para validar alvos usando abordagens farmacológicas. Assim, é imprescindível obter neutrófilos puros e inativados isolados do sangue para validar os achados de modelos de linha celular e animais. Este artigo apresenta um protocolo de isolamento pmn revisado no qual os prós e contras dos métodos atuais foram avaliados10. Uma combinação foi concebida consistindo de centrífuga gradiente para separar pmns de outras células imunes, sedimentação à base de dextran para remover a maior parte das RBCs, lise RBC residual rápida através de pressão osmótica e centrifugação de baixa velocidade para remover a contaminação plaquetária.
Devido ao curto tempo de vida, ao status de diferenciação terminal e ao conteúdo lítico dos neutrófilos, estudar essas células sempre foi um desafio. Além de utilizar modelos ou células de camundongos de coortes de pacientes, as linhas celulares são ferramentas úteis para ajudar a estudar a biologia neutrófila16. No entanto, as linhas celulares semelhantes a neutrófilos não podem reiterar completamente todos os aspectos da biologia neutrófila, adicionando uma camada extra de dificuldade em estudar essas células. O modelo in vitro mais usado é a linha celular HL-60, que pode ser diferenciada em células semelhantes a neutrófilos por tratamento com dimetilsulfoxida ou ácido retinóico17,18. Embora essas células sejam úteis no estudo da migração e da ruptura respiratória, elas não são adequadas para estudar a atividade microbiocida de neutrófilos. Existem outras linhas celulares (PLB-98, NB4), e também estão associadas ao seu conjunto de limitações19.
É fundamental validar com observações primárias de neutrófilos humanos feitas com modelos de doenças de camundongos e linhas celulares. Os neutrófilos não podem ser criopreservados de forma eficiente e, portanto, muitas vezes são recentemente isolados de sangue inteiro ou casacos buffy obtidos de doadores e imediatamente processados. Uma vez isoladas, as células passam a sofrer uma forma complexa de morte espontânea, regulada por oxidação, caspases citoplasmáticas e proteases encontradas nos grânulos de neutrófilos20,21. Métodos ou técnicas de isolamento inadequados podem levar à ativação de neutrófilos, apenas acelerando a morte celular. É imprescindível ter um método confiável e consistente para obter neutrófilos puros e de alta qualidade de doadores.
Foram publicados muitos métodos sobre o isolamento de neutrófiloshumanos 10,22. Eles se enquadram principalmente em duas categorias, com algumas estratégias compartilhadas. A primeira categoria é baseada em anticorpos, seja através de seleção positiva ou negativa. A seleção positiva rotularia diretamente os neutrófilos, fornecendo uma população celular altamente pura, embora também leve à ativação celular rápida, morte celular, bem como marcação indesejada de neutrófilos23. Seleção negativa, embora deixando as células sem rótulo e dando uma população muito pura, acelerou a morte de neutrófilo, embora o mecanismo preciso seja desconhecido(Figura 5). Se a expressão genética ou proteica também é alterada após a seleção positiva ou negativa precisa ser mais investigada. Além disso, devido à quantidade de anticorpos necessários para esgotar os outros tipos de células, esses métodos não podem produzir grandes quantidades de neutrófilos. No entanto, ensaios baseados em anticorpos ainda podem ser usados para cultura de curto prazo e experimentos em menor escala e são métodos de escolha para experimentos que requerem pureza celular muito alta, como estudos de expressão genética e proteica.
O segundo tipo de método de isolamento é baseado em gradiente e densidade. Geralmente envolve percoll, Ficoll-Paque, ou outros componentes de polissacarídeo/polivinylpyrrolidone e utiliza a força de centrifugação para separar diferentes tipos de células sanguíneas com base na densidade celular. Esses métodos são frequentemente complementados com a sedimentação de glóbulos vermelhos pelo dextran. Esses métodos podem lidar com escalas maiores de material inicial e podem alcançar alta pureza também. Uma ressalva do isolamento baseado em densidade é a separação ineficiente de outros granulócitos muito menos abundantes (principalmente eosinófilos) de neutrófilos, e é, portanto, a maior limitação do protocolo apresentado, pois mesmo a presença de contaminação de pequenas células pode afetar a resposta de neutrófilos24.
Apresentado aqui é um método resumido baseado no isolamento gradiente, refinando métodos anteriores10,22. Utilizamos a subestitução atual de especificidades de neutrófilos para isolar de forma confiável nêutrons humanos puros com plaquetas residuais limitadas e RBCs, impedindo a ativação de neutrófilos e morte acelerada. O passo mais crucial é a camada do gradiente, que é muito mais eficazmente obtida adicionando o meio gradiente de densidade sob o sangue para obter uma interface afiada. Um exame rápido do anel PBMC e do gradiente após a centrifugação pode revelar possível contaminação, ativação e baixo rendimento. Ao trabalhar com uma membrana de leucemia ou casaco buffy, diluir o sangue é importante, pois a densidade celular excessiva levaria à agregação celular, levando a impurezas e ativação celular.
Este protocolo deve ser concluído dentro de 2h para garantir o frescor celular, e etapas envolvendo o gradiente de densidade médio, dextran e lise devem ser feitas imediatamente, pois a exposição a essas soluções pode alterar os neutrófilos. Com este protocolo, o rendimento esperado de neutrófilos é de pelo menos ~10 milhões/10 mL de sangue inteiro e pelo menos ~60 milhões/10 mL de casaco buffy. A avaliação da qualidade do isolamento deve ser feita da seguinte forma: os neutrófilos ativados devem ser inferiores a 10%, a contaminação por linfócitos inferior a 5%, o eosinófilo mínimo (mesmo dispersão lateral, mas menor população de dispersão para a frente), e a viabilidade celular deve ser superior a 90%. A menor pureza pode resultar de camadas inadequadas ou armazenamento do gradiente de densidade médio ou devido à qualidade e frescor do produto sanguíneo inicial.
The authors have nothing to disclose.
Este Projeto foi apoiado pelo P01HL095489. A.Y.H foi apoiada pela T32HL066987.
3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell technologies | #07060 | |
Attune NxT | invitrogen | A24858 | FACS analyzer |
Cd11b-PE | biolegend | 301305 | |
CD14-BV421 | biolegend | 367144 | |
CD193-BV605 | biolegend | 310716 | |
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CD62L-PE | biolegend | 304802 | |
CD66b-FITC | biolegend | 305103 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | Centrifuge |
Dextran | Fisher | BP1580 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11150H | complement inactivation of FBS is recommended |
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD | 556547 | |
Hanks balanced salt solution (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4) | Gibco | 14175-095 | HBSS without Ca2+/Mg2+ is advised as they have been shown to lead to neutrohpil activation |
Lymphoprep | Stemcell technologies | #07801 | density gradient medium |
MACSxpress Whole Blood Neutrophil Isolation Kit, human | Miltenyi | 130-104-434 | |
RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | |
Sodium chloride | sigma | 71376 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
ultrapure water | KD medical | RGF-3410 |