Arabidopsis Tohumlarının Yüzey Sterilizasyonu için Yüksek Verimli, Sağlam ve Son Derece Esnek Yöntem
Summary
Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) tohumlarının yüzey sterilizasyonu için yüksek verimli bir protokol sağlanır ve sıvı taşıma adımlarını vakum pompası ile inşa edilmiş basit bir emiş cihazı ile optimize eder. Bir günde yüzlerce tohum örneği yüzey sterilize edilebilir.
Abstract
Arabidopsis, fonksiyonel çalışmalar için en yaygın kullanılan bitki modeli türüdür. Arabidopsis tohumlarının yüzey sterilizasyonu bu amaçla gerekli olan temel bir adımdır. Bu nedenle, aynı anda onlarca ila yüzlerce örneği (örneğin transgenik çizgiler, ekotipler veya mutantlar) işlemek için yüksek verimli Arabidopsis tohum yüzey sterilizasyon yöntemleri oluşturmak çok önemlidir. Bu çalışmada, ortak bir vakum pompasından üretilen ev yapımı bir emme cihazı ile tüplerdeki sıvının verimli bir şekilde ortadan kaldırılmasına dayanan bir tohum yüzey sterilizasyon yöntemi sunulmuştur. Bu yöntemle emek yoğun uygulamalı zamanı önemli ölçüde azaltarak, bir günde birkaç yüzlerce numuneyi işlemek çok az çabayla mümkündür. Seri zaman seyri analizleri, yüksek çimlenme oranlarını koruyarak yüzey sterilizasyonunun son derece esnek bir zaman aralığına işaret etti. Bu yöntem, tohum boyutuna göre emme cihazının basit bir şekilde özelleştirilmesi ve sıvının ortadan kaldırılması için istenen hız ile diğer küçük tohum türlerinin yüzey sterilizasyonu için kolayca uyarlanabilir.
Introduction
Arabidopsis, Brassicaceae familyasına ait bir diploid bitki türüdür. Nispeten kısa yaşam döngüsü (uzun gün yetiştirme koşullarında nesil başına iki ay), küçük bitki büyüklüğü ve bitki başına yüzlerce tohum üretimi ile kendi kendine tozlaşması onu ilk temel bitki modeli türü1,2yaptı. Buna ek olarak, genomu tamamensıralanmıştır 3, kapsamlı ters genetik araçları (doymuş T-DNA, transposon ve kimyasal olarak mutajened popülasyonlar)mevcuttur 4,5,6ve etkili Agrobacteriumaracılı dönüşüm, daha fazla aşağı akış çalışması için yeterli transgenik çizgi elde etmek için iyi kurulmuştur7 . Bu nedenle, son yirmi yıl boyunca, arabidopsis’i, doğal, genetik ve fenotipik varyasyon8,9dahil olmak üzere moleküler düzeyde bitki biyolojisinin çeşitli yönlerini parçalamak için bir model tür olarak kullanarak büyük ilerlemeler elde edilmiştir.
Arabidopsis’e ilgi genlerini işlevsel olarak karakterize etmek için, mantar ve bakteriyel kirleticileri ortadan kaldırmak için tohum yüzey sterilizasyonu, aksinik kültürler gerektiren birçok aşağı akış protokolü için ön koşul adımıdır. Gen fonksiyonunun aşırı ekspresyonu10, devirme (RNA-I11)veya nakavt (genom düzenleme12,13),hücre altı lokalizasyonu14, promotör aktivitesi15 , 16,protein-protein17ve protein-DNA etkileşimi18için genetik dönüşüm , sadece en yaygın uygulamalardan alıntı yapmak için, hepsi bir tohum yüzey sterilizasyonu adımı gerektirir. Bu nedenle, göreceli basitliğine rağmen, tohum yüzey sterilizasyonu birçok fonksiyonel analizde temel bir rol oynar.
Şimdiye kadar, gaz veya sıvı fazlı sterilizasyon19temel alınarak iki ana tohum yüzey sterilizasyonu yöntemi kategorisi geliştirilmiştir. Gaz fazlı tohum yüzey sterilizasyonunun verimi orta ila yüksek olsa da, tehlikeli reaktif klor gazını yüzey sterilizasyon maddesi olarak kullanmak geniş uygulamasını engellemiştir. Sıvı fazlı sterilizasyona dayanan yöntemler, aksine, yüzey sterilizasyonu için etanol ve çamaşır suyu çözeltileri gibi daha hafif kimyasallara dayanır ve doğal olarak klor fümigasyonundan daha düşük verime sahip olmalarına rağmen daha yaygın olarak kullanılırlar. Genel olarak, sıvı reaktifleri kullanan iki farklı yöntem yaygın olarak kullanılmaktadır. Büyük ölçüde kullanılan bir yöntem, farklı konsantrasyonlarda etanol ve çamaşır suyu ile farklı sürelerde yıkamaya dayanır20,21. Başka bir yöntem çamaşır suyu uygulamasına dayanır sadece21,22. Her iki yöntem de esas olarak küçük ölçekli tohum yüzey sterilizasyonu için uygulanmaktadır. Bununla birlikte, birçok deneyde, bir dönüşümden türetilen birçok Arabidopsis transgenik çizginin taranması gerekir15,23 veya ekran paralel olarak farklı dönüşümlerden oluşturulan birçok transgenik çizgi 24,25. Bilgimiz dahilinde, yüksek verimli tohum yüzey sterilizasyonu için sıvı bazlı bir yöntem yayınlanmamıştır, bu da çok az tanınmasına rağmen, fonksiyonel genomik yaklaşımlar için önemli bir darboğaz oluşturmaktadır. Bu nedenle, tohum yüzey sterilizasyonu için güvenli, sağlam ve yüksek verimli yöntemler geliştirmek, birçok genin aynı anda fonksiyonel karakterizasyonunun başarısı için gerekli ve kritik bir adımdır.
Bu amaçla, mevcut çalışmada, Arabidopsis tohumlarının yüzey sterilizasyonu için geliştirilmiş bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem güvenli, düşük maliyetli, son derece sağlam ve yüksek verime sahiptir ve tohum yüzey sterilizasyonunun başlangıcından Petri kaplarında tohum ekiminin sonuna kadar bir saat içinde 96 bağımsız hattın işlenmesine izin verir. Gösterilen yöntem, vakum pompası, sarf malzemesi züccaciye ve plastik gereçler gibi yaygın olarak bulunan temel laboratuvar araçlarına dayanmaktadır. Bu geliştirilmiş yöntem, arabidopsis ve diğer model olmayan bitki türlerinde modern fonksiyonel genomik yaklaşımlara yeterli bir verimle tohum yüzey sterilizasyonunu kolaylaştırmak için bilim topluluğuna güvenli, basit ve uygun fiyatlı bir yaklaşım sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tohumların sterilizasyonu Arabidopsis’te fonksiyonel çalışmalar için temel adımdır. Birçok farklı amaç için sıkça yapılmasına rağmen Arabidopsis’te yüksek verimli tohum yüzey sterilizasyonu ile ilgili sınırlı çalışmalar mevcuttur.
Şimdiye kadar, en yüksek verime sahip yöntemlerden biri, çamaşır suyunu konsantre HCl ile karıştırarak üretilen klor gazı kullanmaktır. Bu yöntem sınırlı uygulamalı zaman gerektirmesine rağmen, insanlar için oldukça zehirli…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Fondazione E. Mach’in Ecogenomics grubunun temel finansmanı yoluyla Trento Özerk Eyaleti tarafından finanse edildi.
Materials
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
Referencias
- Somerville, C., Koornneef, M. A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant. Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Initiative, T. A. G. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).
- Speulman, E., et al. A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome. Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).
- Jander, G., et al. Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance. Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -. S., Niu, Q. -. W., Chua, N. -. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Togninalli, M., et al. AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).
- Lan, Y., et al. AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database. Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).
- Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).
- Czarnecki, O., et al. Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).
- Yan, L., et al. high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).
- Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system. Horticulture Research. 6 (1), (2019).
- Grefen, C., et al. Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members. Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).
- Gazzani, S., et al. Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae. BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).
- Lee, S., Korban, S. S. Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development. Planta. 215 (4), 689-693 (2002).
- Long, Y., et al. In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots. Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).
- Freire-Rios, A., et al. Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).
- Rivero, L., et al. Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).
- Chen, J. H., et al. Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid. Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).
- Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).
- Mathur, J., Koncz, C. Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols. Methods in Molecular Biology. 82, 27-30 (1998).
- Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS. Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).
- Li, M., et al. In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases. Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).
- Li, M., et al. Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms). Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods in Molecular Biology. 343, 87-104 (2006).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition. ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).
- Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds. Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).
- Acemi, A., Özen, F. Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea. The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).
