طريقة عالية الإنتاجية وقوية ومرنة للغاية للوقت للتعقيم السطحي لبذور Arabidopsis
Summary
يتم توفير بروتوكول عالي الإنتاجية للتعقيم السطحي لبذور Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) ، وتحسين خطوات التعامل مع السائل باستخدام جهاز شفط بسيط تم بناؤه بمضخة فراغ. يمكن تعقيم مئات عينات البذور في يوم واحد.
Abstract
أربيدوبسيس هو إلى حد بعيد الأنواع نموذج النبات الأكثر استخداما على نطاق واسع للدراسات الوظيفية. التعقيم السطحي لبذور أربيدوبسيس هو خطوة أساسية مطلوبة لتحقيق هذه الغاية. وبالتالي، من الأهمية بمكان إنشاء طرق عالية الإنتاجية لتعقيم سطح بذور أربيدوبسيس للتعامل مع عشرات إلى مئات العينات (على سبيل المثال، الخطوط المعدلة وراثيا، أو الأنماط الإيكولوجية، أو المسوخ) في وقت واحد. يتم تقديم طريقة التعقيم السطحي للبذور على أساس القضاء الفعال على السائل في الأنابيب مع جهاز شفط محلي الصنع تم بناؤه من مضخة فراغ مشتركة في هذه الدراسة. من خلال الحد بشكل كبير من العمل الكثيف التدريب العملي على الوقت مع هذه الطريقة التعامل مع عدة مئات من العينات في يوم واحد ممكن مع القليل من الجهد. كما أشارت تحليلات الدورة الزمنية السلسلية إلى نطاق زمني مرن للغاية للتعقيم السطحي من خلال الحفاظ على معدلات إنبات عالية. يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة للتعقيم السطحي لأنواع أخرى من البذور الصغيرة مع تخصيص بسيط لجهاز الشفط وفقا لحجم البذور ، والسرعة المطلوبة للقضاء على السائل.
Introduction
أربيدوبسيس هو نوع نباتي ثنائي الفصي ينتمي إلى عائلة براسيكاي. دورة حياتها قصيرة نسبيا (شهرين لكل جيل في ظل ظروف النمو ليوم طويل)، وحجم النبات الصغير، والتلقيح الذاتي مع إنتاج مئات البذور لكل نبات جعلت من أول نوع نموذج نباتي أساسي1،2. وبالإضافة إلى ذلك، كان تسلسل الجينوم لها تماما3،واسعة أدوات علم الوراثة العكسي (المشبعة T-DNA، transposon، والسكان المعدلة كيميائيا) متوفرة4،5،6، وفعالة Agrobacterium-بوساطة التحول راسخة للحصول على خطوط معدلة وراثيا كافية لمزيد من العمل المصب7 . وهكذا، خلال العقدين الماضيين، تم تحقيق تقدم كبير باستخدام Arabidopsis كنوع نموذجي لتشريح جوانب متنوعة من بيولوجيا النبات على المستوى الجزيئي، بما في ذلك الاختلاف الطبيعي والوراثي والفينوتيبيك8،9.
لتوصيف وظيفيا الجينات ذات الاهتمام في Arabidopsis، التعقيم السطحي البذور للقضاء على الملوثات الفطرية والبكتيرية هو الخطوة الأساسية لكثير من بروتوكولات المصب التي تتطلب الثقافات المحورية. التحول الوراثي لفرط التعبير10، الضربة القاضية (RNA-I11)أو خروج المغلوب (تحرير الجينوم12،13)من وظيفة الجينات ، توطين subcellular14، نشاط المروج15،16، البروتين البروتين17 والتفاعل بين البروتين والحمض النووي18، على سبيل المثال لا يذكر سوى التطبيقات الأكثر شيوعا ، وكلها تتطلب خطوة التعقيم سطح البذور. وهكذا، على الرغم من بساطته النسبية، يلعب تعقيم سطح البذور دورا أساسيا في العديد من التحليلات الوظيفية.
حتى الآن، وقد وضعت فئتين رئيسيتين من أساليب التعقيم السطحي البذور على أساس إما الغاز أو على التعقيم في مرحلة السائل19. وفي حين أن إنتاجية التعقيم السطحي للبذور في مرحلة الغاز متوسطة إلى عالية، فإن استخدام غاز الكلور الكاشف الخطر كعامل تعقيم سطحي أعاق تطبيقه على نطاق واسع. تعتمد الطرق القائمة على التعقيم في المرحلة السائلة ، على العكس من ذلك ، على مواد كيميائية أكثر اعتدالا مثل الإيثانول وحلول التبييض للتعقيم السطحي ، وتستخدم على نطاق أوسع على الرغم من أن إنتاجها أقل بطبيعته من تبخير الكلور. بشكل عام، يتم استخدام طريقتين مختلفتين تستخدمان الكواشف السائلة بشكل عام. ويستند أسلوب واحد يستخدم إلى حد كبير على الغسيل مع الإيثانول والتبييض بتركيزات مختلفة لمدة مختلفة من الوقت20،21. ويستند أسلوب آخر على تطبيق التبييض فقط21،22. وتطبق كلتا الطريقتين أساسا لتعقيم سطح البذور على نطاق صغير. ومع ذلك، في العديد من التجارب، فمن الضروري لفحص العديد من خطوط أربيدوبسي المعدلة وراثيا المستمدة من تحويل واحد15،23 أو الشاشة في موازاة العديد من خطوط المعدلة وراثيا ولدت من التحولات المختلفة24،25. وعلى حد علمنا، لم تنشر أي طريقة قائمة على السوائل لتعقيم سطح البذور عالي الإنتاجية، مما يشكل، على الرغم من عدم الاعتراف به، اختناقا هاما لنهج الجينوم الوظيفي. لذلك، تطوير أساليب آمنة وقوية وعالية الإنتاجية لتعقيم سطح البذور هو خطوة ضرورية وحاسمة نحو نجاح التوصيف الوظيفي للعديد من الجينات في وقت واحد.
وتحقيقا لهذه الغاية، في الدراسة الحالية، يتم تقديم طريقة محسنة للتعقيم السطحي لبذور الأرابيدوسيس. هذه الطريقة آمنة ومنخفضة التكلفة وقوية للغاية وعالية الإنتاجية ، مما يسمح بالتعامل مع 96 خطا مستقلا في غضون ساعة واحدة من بداية تعقيم سطح البذور حتى نهاية بذر البذور في أطباق بيتري. تعتمد الطريقة التي أثبتت على الأجهزة المختبرية الأساسية المتاحة على نطاق واسع مثل مضخة فراغ ، وأواني زجاجية قابلة للاستهلاك ، وأدوات بلاستيكية. توفر هذه الطريقة المحسنة للمجتمع العلمي نهجا آمنا وبسيطا وبأسعار معقولة لتبسيط تعقيم سطح البذور مع إنتاجية كافية لنهج الجينوم الوظيفي الحديث في Arabidopsis وغيرها من الأنواع النباتية غير النموذجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعقيم البذور هو الخطوة الأساسية للدراسات الوظيفية في Arabidopsis. على الرغم من أنه كثيرا ما يتم تنفيذها لأغراض مختلفة كثيرة، تتوفر دراسات محدودة على التعقيم السطحي للبذور عالية الإنتاجية في Arabidopsis.
حتى الآن، واحدة من الطرق ذات الإنتاجية العالية هي استخدام غاز الكلور الناتج عن خ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل مقاطعة ترينتو المستقلة من خلال التمويل الأساسي لمجموعة الاقتصاد البيئي التابعة لمنظمة فوندازيون ماخ.
Materials
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
Referencias
- Somerville, C., Koornneef, M. A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant. Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Initiative, T. A. G. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).
- Speulman, E., et al. A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome. Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).
- Jander, G., et al. Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance. Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -. S., Niu, Q. -. W., Chua, N. -. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Togninalli, M., et al. AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).
- Lan, Y., et al. AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database. Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).
- Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).
- Czarnecki, O., et al. Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).
- Yan, L., et al. high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).
- Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system. Horticulture Research. 6 (1), (2019).
- Grefen, C., et al. Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members. Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).
- Gazzani, S., et al. Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae. BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).
- Lee, S., Korban, S. S. Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development. Planta. 215 (4), 689-693 (2002).
- Long, Y., et al. In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots. Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).
- Freire-Rios, A., et al. Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).
- Rivero, L., et al. Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).
- Chen, J. H., et al. Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid. Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).
- Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).
- Mathur, J., Koncz, C. Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols. Methods in Molecular Biology. 82, 27-30 (1998).
- Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS. Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).
- Li, M., et al. In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases. Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).
- Li, M., et al. Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms). Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods in Molecular Biology. 343, 87-104 (2006).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition. ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).
- Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds. Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).
- Acemi, A., Özen, F. Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea. The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).
