Enregistrement de l’activité du réseau dans les circuits nociceptifs rachidiens à l’aide de réseaux de microélectrodes
Summary
L’utilisation combinée de la technologie des réseaux de microélectrodes et de la stimulation chimique induite par la 4-aminopyridine pour étudier l’activité nociceptive au niveau du réseau dans la corne dorsale de la moelle épinière est décrite.
Abstract
Les rôles et la connectivité de types spécifiques de neurones dans la corne dorsale de la moelle épinière (DH) sont délimités à un rythme rapide pour fournir une vue de plus en plus détaillée des circuits qui sous-tendent le traitement de la douleur vertébrale. Cependant, les effets de ces connexions sur l’activité plus large du réseau dans la DH restent moins bien compris car la plupart des études se concentrent sur l’activité de neurones uniques et de petits microcircuits. Alternativement, l’utilisation de réseaux de microélectrodes (MEA), qui peuvent surveiller l’activité électrique à travers de nombreuses cellules, fournit une résolution spatiale et temporelle élevée de l’activité neuronale. Ici, l’utilisation d’AME avec des tranches de moelle épinière de souris pour étudier l’activité de la DH induite par la stimulation chimique des circuits de DH avec la 4-aminopyridine (4-AP) est décrite. L’activité rythmique résultante est limitée à la DH superficielle, stable dans le temps, bloquée par la tétrodotoxine, et peut être étudiée dans différentes orientations de tranches. Ensemble, cette préparation fournit une plate-forme pour étudier l’activité du circuit DH dans les tissus d’animaux naïfs, de modèles animaux de douleur chronique et de souris ayant une fonction nociceptive génétiquement modifiée. En outre, les enregistrements MEA dans les tranches de moelle épinière stimulées par 4-AP peuvent être utilisés comme outil de dépistage rapide pour évaluer la capacité de nouveaux composés antinociceptifs à perturber l’activité dans la moelle épinière DH.
Introduction
Les rôles de types spécifiques d’interneurones inhibiteurs et excitateurs dans la moelle épinière DH sont découverts à un rythme rapide 1,2,3,4. Ensemble, les interneurones représentent plus de 95% des neurones de la DH et sont impliqués dans le traitement sensoriel, y compris la nociception. De plus, ces circuits interneurones sont importants pour déterminer si les signaux périphériques montent dans l’axe du neuroaxe pour atteindre le cerveau et contribuer à la perception de la douleur 5,6,7. À ce jour, la plupart des études ont étudié le rôle des neurones DH au niveau de l’analyse unicellulaire ou de l’organisme entier en utilisant des combinaisons d’électrophysiologie intracellulaire in vitro, de marquage neuroanatomique et d’analyse comportementale in vivo 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Ces approches ont considérablement fait progresser la compréhension du rôle de populations de neurones spécifiques dans le traitement de la douleur. Cependant, une lacune subsiste dans la compréhension de la façon dont des types cellulaires spécifiques et de petits macro-circuits influencent de grandes populations de neurones au niveau des microcircuits pour façonner ensuite la sortie de la DH, les réponses comportementales et l’expérience de la douleur.
Une technologie qui peut étudier la fonction de macro-circuit ou multicellulaire est le réseau de microélectrodes (MEA)15,16. Les MEA sont utilisés pour étudier le fonctionnement du système nerveux depuis plusieurs décennies17,18. Dans le cerveau, ils ont facilité l’étude du développement neuronal, de la plasticité synaptique, du dépistage pharmacologique et des tests de toxicité17,18. Ils peuvent être utilisés pour des applications in vitro et in vivo, selon le type de MEA. En outre, le développement des MEA a évolué rapidement, avec différents nombres et configurations d’électrodes désormais disponibles19. L’un des principaux avantages des MEA est leur capacité à évaluer simultanément l’activité électrique dans de nombreux neurones avec une grande précision spatiale et temporelle via plusieurs électrodes15,16. Cela fournit une lecture plus large de la façon dont les neurones interagissent dans les circuits et les réseaux, dans des conditions de contrôle et en présence de composés appliqués localement.
L’un des défis des préparations in vitro de DH est que les niveaux d’activité continue sont généralement faibles. Ici, ce défi est abordé dans les circuits DH de la moelle épinière en utilisant le bloqueur de canal K + voltage-dépendant, la 4-aminopryidine (4-AP), pour stimuler chimiquement les circuits DH. Ce médicament a déjà été utilisé pour établir une activité électrique synchrone rythmique dans la DH des tranches aiguës de la moelle épinière et dans des conditions aiguës in vivo 20,21,22,23,24. Ces expériences ont utilisé un patch unicellulaire et un enregistrement extracellulaire ou l’imagerie calcique pour caractériser l’activitéinduite par le 4-AP 20,21,22,23,24,25. Ensemble, ces travaux ont démontré l’exigence d’une transmission synaptique excitatrice et inhibitrice et de synapses électriques pour une activité rythmique induite par le 4-AP. Ainsi, la réponse 4-AP a été considérée comme une approche qui démasque les circuits DH polysynaptiques natifs ayant une pertinence biologique plutôt que comme un épiphénomène induit par un médicament. En outre, l’activité induite par le 4-AP présente un profil de réponse similaire aux analgésiques et aux antiépileptiques que les affections douloureuses neuropathiques et a été utilisée pour proposer de nouvelles cibles médicamenteuses analgésiques à base rachidienne telles que les connexines 20,21,22.
Ici, une préparation qui combine les MEA et l’activation chimique de la DH spinale avec le 4-AP pour étudier ce circuit nociceptif au niveau du macro-circuit, ou réseau d’analyse, est décrite. Cette approche fournit une plate-forme stable et reproductible pour étudier les circuits nociceptifs dans des conditions naïves et neuropathiques « semblables à la douleur ». Cette préparation est également facilement applicable pour tester l’action au niveau du circuit des analgésiques connus et pour dépister de nouveaux analgésiques dans la moelle épinière hyperactive.
Protocol
Representative Results
Discussion
Malgré l’importance de la DH spinale dans la signalisation nociceptive, le traitement et les réponses comportementales et émotionnelles qui en résultent qui caractérisent la douleur, les circuits de cette région restent mal compris. L’un des principaux défis dans l’étude de cette question a été la diversité des populations de neurones qui composent ces circuits 6,31,32. Les progrès récents des tech…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le National Health and Medical Research Council (NHMRC) d’Australie (subventions 631000, 1043933, 1144638 et 1184974 à B.A.G. et R.J.C.) et le Hunter Medical Research Institute (subvention à B.A.G. et R.J.C.).
Materials
| 4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
| 100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
| CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
| Carbonox (Carbogen – 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
| Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
| Custom made air interface incubation chamber | |||
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
| Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
| KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
| Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
| Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
| MATLAB | MathWorks | R2018b | |
| MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8×8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
| MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
| MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
| MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
| MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
| MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8×8 square grid (200/30) or a 6×10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
| MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
| Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
| Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
| NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
| NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
| Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
| Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
| Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |
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