TDP-43 Proteinopatisinin Drosophila Modellerinde Glikoz Alımının Ölçülmesi
Summary
TAR DNA bağlayıcı protein (TDP-43) proteinopatisi tarafından etkilenen Drosophila motor nöronlarında, FRET tabanlı, genetik olarak kodlanmış bir glikoz sensörü tarafından belirtildiği gibi glikoz alımı artar.
Abstract
Amyotrofik lateral skleroz, tanıyı takip eden 2-5 yıl içinde ilerleyici kas güçsüzlüğüne ve ölüme neden olan nörodejeneratif bir bozukluktur. Klinik bulgular arasında kilo kaybı, dislipidemi ve hipermetabolizm sayılabilir; bununla birlikte, bunların motor nöron dejenerasyonu ile nasıl ilişkili olduğu belirsizliğini korumaktadır. Sitoplazmik inklüzyonlar, lokomotor disfonksiyonu ve azaltılmış yaşam süresi dahil olmak üzere ALS’nin çeşitli özelliklerini yeniden sağlayan bir Drosophila TDP-43 proteinopati modeli kullanarak, yakın zamanda geniş kapsamlı metabolik eksiklikler tespit ettik. Bunlar arasında glikolizin güncel olduğu tespit edildi ve genetik etkileşim deneyleri telafi edici bir nöroprotektif mekanizma için kanıt sağladı. Nitekim, glikolizde enzim oranını sınırlayan fosfolreküsyona rağmen, diyet ve genetik manipülasyonlar kullanılarak glikolizde bir artış, TDP-43 proteinopatisinin sinek modellerinde lokomotor disfonksiyonunu ve yaşam süresini artırdığı gösterilmiştir. Motor nöronlarda TDP-43 proteinopatisinin glikolitik akı üzerindeki etkisini daha fazla araştırmak için, daha önce genetik olarak kodlanmış, FRET tabanlı bir sensör olan FLII12Pglu-700μδ6 kullanıldı. Bu sensör, bakteriyel glikoz algılama etki alanı ve FRET çifti olarak siyan ve sarı floresan proteinlerden oluşur. Glikoz bağlanması üzerine sensör, FRET’in gerçekleşmesine izin vererek konformasyonsal bir değişikliğe uğrar. FLII12Pglu-700μδ6 kullanılarak, glikoz alımının ALS’ye neden olan bir varyant olan TDP-43G298S’yiifade eden motor nöronlarda önemli ölçüde arttığı bulunmuştur. Burada, TDP-43 proteinopatisi bağlamında Glikoz sensörü FLII12Pglu-700μδ6’yı ifade eden larva ventral sinir kordonu preparatlarında glikoz alımının nasıl ölçüldüğünü gösteriyoruz. Bu yaklaşım, glikoz alımını ölçmek ve farklı hücre tiplerinde glikolitik akıyı değerlendirmek veya ALS ve ilgili nörodejeneratif bozukluklara neden olan çeşitli mutasyonlar bağlamında kullanılabilir.
Introduction
Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) şu anda tedavi edilemeyen ilerleyici bir nörodejeneratif bozukluktur. ALS, tanıdan sonraki 2-5 yıl içinde motor koordinasyon kaybına, geri dönüşü olmayan felce, solunum yetmezliğine ve nihai ölüme yol açan üst ve alt motor nöronları etkiler1. ALS kilo kaybı, dislipidemi ve hipermetabolizm gibi metabolik defektlerle ilişkilidir(2’degözden geçirilmiştir); bununla birlikte, metabolizmadaki bu değişikliklerin motor nöron dejenerasyonu ile nasıl ilişkili olduğu belirsizliğini korumaktadır. ALS ve ilgili nörodejeneratif hastalıklarda ortak bir payda, RNA işleme 3,4 , 5’in çeşitli adımlarında yer alan nükleik asit bağlayıcı bir protein olan TDP-43’tür. TDP-43’teki mutasyonlar hastaların sadece %3-5’ini etkilese de, ALS vakalarının %97′> sinde sitoplazmik agregalarda vahşi tip TDP-43 proteini bulunur(6’dagözden geçirilmiştir). Bu patoloji Drosophila’da, sitoplazmik inklüzyonlar, lokomotor disfonksiyonu ve azaltılmış ömür dahil olmak üzere ALS’nin birçok yönünü yeniden oluşturan motor nöronlarda insan wildtype veya mutant TDP-43’ün (G298S) aşırı ifade edilmesiyle modellenmiştir7,8. Bu modeller kullanılarak, son zamanlarda TDP-43 proteinopatisinin piruvat seviyelerinde ve glikoliz9’unhız sınırlayıcı enzimi olan fosfolroktokinaz (PFK) mRNA’da önemli bir artışa neden olduğu bildirilmiştir. PFK transkriptlerinde benzer artışlar hasta kaynaklı motor nöronlarda ve omuriliklerde de bulundu ve glikolizin TDP-43 proteinopatisi bağlamında güncellendiğini düşündürmektedir. İlginçtir ki, diyet ve genetik manipülasyonlar kullanarak glikolizdeki daha fazla artış, TDP-43 proteinopatisinin sinek modellerinde, dejenere motor nöronlarda telafi edici, nöroprotektif bir mekanizma ile tutarlı olarak, lokomotor disfonksiyonu ve artan yaşam süresi gibi birkaç ALS fenotipini hafifletti.
Glikolizdeki değişiklikleri daha fazla araştırmak ve TDP-43 proteinopatisinin Drosophila modellerinde glikoz alımını ölçmek için, daha önce bildirilen genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı sensör FLII12Pglu-700μδ610, özellikle UAS-GAL4 ekspresyon sistemi kullanılarak motor nöronlarda ifade edildi. FLII12Pglu-700μδ6 glikoz sensörü, glikozu hücresel düzeyde tespit etmek için yeşil floresan protein, siyan ve sarı floresan proteinlerin (CFP ve YFP) iki çeşidi arasında rezonans enerjisi transferi kullanır. Molekülün zıt uçlarında CFP ve YFP’ye kaynaşmış E. coli MglB geninden bakteriyel glikoz bağlayıcı etki alanından oluşur. Bir glikoz molekülüne bağlandığında, sensör CFP ve YFP’yi birbirine yaklaştıran ve FRET’in oluşmasına izin veren, daha sonra hücre içi glikoz seviyelerini ölçmek için kullanılabilecek konformasyonel bir değişikliğe uğrar10,11,12 ( Şekil1). Burada, FLII12Pglu-700μδ6 sensörünün motor nöronlarda TDP-43 proteinopatisinin neden olduğu glikoz alımındaki değişiklikleri belirlemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Burada açıklanan deneyler, ALS ile ilişkili bir mutant olan TDP-43G298S‘nin motor nöronlarda aşırı ifade alınmasının, kontrollere kıyasla glikoz alımında önemli bir artışa neden olduğunu göstermektedir. Bu yaklaşım, nörodejenerasyonla ilişkili glikoz alımındaki değişiklikleri belirlemek için diğer ALS türlerinde (örneğin, SOD1, C9orf72, vb.) ve/veya diğer hücre tiplerinde (örneğin, glia, kaslar) kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada ayrıntılı olarak açıklanan teknik, glikoz seviyelerindeki değişiklikleri milimolerbiraralık 10 , 11,12’ye kadar algılayabilen FRET tabanlı bir sensör olan FLII12Pglu-700μδ6 kullanılarak canlı Drosophila’ya belirli bir hücre türünde glikoz alımını ölçmek içinuygulanabilir. Bu sensör daha önce UAS-GAL4 sistemi ile birlikte, ifadesini nöronlar9,<sup class…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stefanie Schirmeier ve Takeshi Iwatsubo’ya Drosophila suşları sağladıkları için teşekkür ederiz. Patricia Jansma’ya Arizona Üniversitesi’ndeki Marley Görüntüleme Çekirdeği’nde görüntülemeye yardımcı olduğu için de teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri NIH NS091299, NS115514 (DCZ’ye), HHMI Gilliam Bursu (EM’ye) ve Lisans Biyolojisi Araştırma Programı (HB’ye) tarafından finanse edildi.
Materials
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
Referencias
- Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).
- Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis. The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).
- Buratti, E., Baralle, F. E. Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9. The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).
- Polymenidou, M., et al. Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).
- Tollervey, J. R., et al. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).
- Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
- Estes, P. S., et al. Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS. Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).
- Estes, P. S., et al. Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).
- Manzo, E., et al. Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS. eLife. 8, 45114 (2019).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106, 55-64 (2018).
- Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- Ihara, R., et al. RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy. Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Lu, B., Vogel, H. Drosophila models of neurodegenerative diseases. Annual Review of Pathology. 4, 315-342 (2009).
