We presenteren een experimenteel protocol en data-analyseworkflow om live cell dual-color fluorescentie cross correlation spectroscopie (FCCS) uit te voeren in combinatie met Förster Resonance Energy transfer (FRET) om membraanreceptordynamica in levende cellen te bestuderen met behulp van moderne fluorescentielabeltechnieken.
We presenteren een protocol en workflow om live cell dual-color fluorescentie cross-correlation spectroscopie (FCCS) uit te voeren in combinatie met Förster Resonance Energy transfer (FRET) om membraanreceptordynamica in levende cellen te bestuderen met behulp van moderne fluorescentielabeltechnieken. In dual-color FCCS, waar de fluctuaties in fluorescentie-intensiteit de dynamische “vingerafdruk” van het respectieve fluorescerende biomolecuul vertegenwoordigen, kunnen we co-diffusie of binding van de receptoren onderzoeken. FRET, met zijn hoge gevoeligheid voor moleculaire afstanden, dient als een bekende “nanoruler” om intramoleculaire veranderingen te monitoren. Samen worden conformaaire veranderingen en belangrijke parameters zoals lokale receptorconcentraties en mobiliteitsconstanten toegankelijk in cellulaire omgevingen.
Kwantitatieve fluorescentiebenaderingen zijn een uitdaging in cellen vanwege hoge geluidsniveaus en de kwetsbaarheid van het monster. Hier laten we zien hoe dit experiment moet worden uitgevoerd, inclusief de kalibratiestappen met behulp van twee kleuren gelabelde β2-adrenerge receptor (β2AR) gelabeld met eGFP en SNAP-tag-TAMRA. Een stapsgewijze gegevensanalyseprocedure wordt aangeboden met behulp van open-source software en sjablonen die eenvoudig kunnen worden aangepast.
Onze richtlijn stelt onderzoekers in staat om moleculaire interacties van biomoleculen in levende cellen in situ met hoge betrouwbaarheid te ontrafelen, ondanks de beperkte signaal-naar-ruisniveaus in experimenten met levende cellen. Het operationele venster van FRET en met name FCCS bij lage concentraties maakt kwantitatieve analyse bij bijna fysiologische omstandigheden mogelijk.
Fluorescentiespectroscopie is een van de belangrijkste methoden om eiwitdynamica en eiwit-eiwitinteracties te kwantificeren met minimale verstoring in een cellulaire context. Confocale fluorescentiescorrelatiespectroscopie (FCS) is een van de krachtige methoden om moleculaire dynamica te analyseren, omdat het gevoelig is voor één molecuul, zeer selectief en compatibel met levende cellen1. In vergelijking met andere dynamiekgerichte benaderingen heeft FCS een breder meetbaar tijdsbereik dat zich uitstrekt van ~ ns tot ~ s, met name de snelle tijdschalen die vaak ontoegankelijk zijn door op beeldvorming gebaseerde methoden. Bovendien biedt het ook ruimtelijke selectiviteit, zodat membraan-, cytoplasmatische en kernmoleculaire dynamica gemakkelijk kan worden onderscheiden 2. Zo kunnen moleculair knipperen, de gemiddelde lokale concentratie en de diffusiecoëfficiënt kwantitatief worden geanalyseerd met FCS. Intermoleculaire dynamica zoals binding worden gemakkelijk toegankelijk bij het onderzoeken van co-diffusie van twee moleculaire soorten in fluorescentie cross-correlation spectroscopie (FCCS) analyse3,4,5 in een tweekleurige benadering.
Het belangrijkste onderliggende principe bij correlatiespectroscopie is de statistische analyse van intensiteitsfluctuaties die worden uitgezonden door fluorescerend gelabelde biomoleculen die in en uit een laserfocus diffuus zijn(figuur 1A). De resulterende auto- of kruiscorrelatiefuncties kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd door curve-aanpassing om uiteindelijk de renteconstanten af te leiden. Met andere woorden, de statistische methoden FCS en FCCS bieden geen sporen van één molecuul zoals bij het volgen van enkele deeltjes, maar een dynamisch patroon of “vingerafdruk” van een gesondeerd monster met een hoge temporele resolutie. In combinatie met Förster resonantie energieoverdracht (FRET) kan intramoleculaire dynamica zoals conformatieveranderingen tegelijkertijd worden gevolgd in een gemeenschappelijke confocale opstelling5,6. FRET onderzoekt de afstand van twee fluoroforen en wordt vaak een moleculaire “nanoruler” genoemd. Energieoverdracht vindt alleen plaats wanneer de moleculen zich in de nabijheid bevinden (< 10 nm), het emissiespectrum van de donor aanzienlijk overlapt met het absorptiespectrum van het acceptormolecuul en de dipooloriëntatie van de donor en acceptor (voldoende) parallel is. De combinatie van FRET en FCCS biedt dus een techniek met een zeer hoge spatio-temporele resolutie. Wanneer ruimtelijke selectiviteit, gevoeligheid en live-celcompatibiliteit vereist is, heeft FRET-FCCS duidelijk voordeel ten opzichte van andere methoden zoals isotherme titratiecalorimetrie (ITC)7,Oppervlakte plasmonresonantie (SPR)8of nucleaire magnetische resonantie (NMR)9,10 voor het meten van eiwitdynamica en interacties.
Ondanks de mogelijkheden en belofte van tweekleurige fluorescentie cross-correlatie spectroscopie (dc-FCCS), is het uitvoeren van dc-FCCS in levende cellen technisch uitdagend vanwege de spectrale doorbloeding of overspraak tussen de kanalen3,4,het verschil in de confocale volumes als gevolg van de spectraal verschillende laserlijnen3,4,11,achtergrondsignaal en ruis of beperkte fotostabiliteit van de monsters12, 13,14,15. De introductie van pulse interleaved excitation (PIE) in FCCS was een belangrijke aanpassing om de verschillende laserexcitaties tijdelijk los te koppelen voor het verminderen van de spectrale overspraak tussen de kanalen16. Andere correctiemethoden om spectrale doorbloeding17,18,19 en achtergrondcorrecties tegen te gaan, zijn ook goed geaccepteerd17,18,19. Voor details en basisprincipes over FCS, PIE of FRET wordt de lezer verwezen naar de volgende referenties2,4,6,16,20,21,22,23,24.
Hier worden alle noodzakelijke kalibratie-experimenten en analyses samen met de experimentele resultaten van een prototypische G-eiwit gekoppelde receptor, β2-adrenerge receptor (β2AR), voor drie verschillende scenario’s gepresenteerd: (1) enkelgelabelde moleculen met een “groene” (eGFP) of een “rode” (SNAP-tag-gebaseerde etikettering)25 fluorofoor; (2) een dubbel gelabeld construct, dat een N-terminal SNAP-tag en intracellulaire eGFP (NT-SNAP) draagt [in dit geval bevinden beide labels zich op hetzelfde eiwit. Er wordt dus 100% co-diffusie verwacht]; en (3) een dubbel gelabeld monster, waarbij beide fluoroforen zich aan dezelfde kant van het celmembraan bevinden (CT-SNAP). Het draagt een C-terminal SNAP-tag en een intracellulaire eGFP. Ook hier zitten beide labels op hetzelfde eiwit met wederom 100% co-diffusie verwacht. Omdat beide labels zeer dicht bij elkaar liggen, aan dezelfde kant van het celmembraan, toont het het potentieel om FRET en anticorrelief gedrag te observeren. Alle constructies werden getransfecteerd in Chinese Hamster Ovary (CHO) cellen en later gelabeld met een rood fluorescerend substraat dat membraan-ondoordringbaar is voor de NT-SNAP-constructie en membraandoorlatend voor de CT-SNAP-constructie. Ten slotte illustreren gesimuleerde gegevens de invloed van experimentele parameters op de FRET-geïnduceerde anticorrelatie en het effect van eiwit-eiwitinteracties op de codiffusieamplitude.
Dit protocol biedt dus een complete gids voor het uitvoeren van de gecombineerde FRET-FCCS in levende cellen om eiwitdynamiek en eiwit-eiwitinteracties te begrijpen en tegelijkertijd bewust te worden van technische / fysieke artefacten, uitdagingen en mogelijke oplossingen.
FCS-technieken in GPCRs maken het mogelijk de mobiliteit en interacties van receptoren in levende cellen te beoordelen41. Het voordeel van de FRET-FCS techniek is dat, naast mobiliteit, de conformatiedynamiek van GPCRs kan worden onderzocht. Het uitvoeren van FRET-FCS in levende cellen is echter een uitdaging en vereist cellen die een lage (of maximaal matige) expressie van het fluorescerend gelabelde eiwit van belang vertonen, een goed gekalibreerde opstelling en een goede pijplijn om gegevens te analyseren. Hier worden eerst de kritische punten in de monstervoorbereiding en experimentele procedure besproken met betrekking tot de biologische, spectroscopische en technische gezichtspunten.
Kritische experimentele stappen omvatten het minimaliseren van de achtergrond en autofluorescentie (door het gebruik van uitgebreid gereinigde coverslips en fenolrode vrije media), de optimalisatie van transfectieomstandigheden (bijv. Hoeveelheid plasmide-DNA en tijd na transfectie) om lage expressieniveaus en efficiënte etikettering te bereiken. Natuurlijk is het ook van vitaal belang om ervoor te zorgen dat de functie van het gelabelde eiwit niet wordt belemmerd. In live-celexperimenten wordt de beslissing voor de etiketteringsstrategie en labelpositie dus vaak genomen ten gunste van fluorescerende eiwitten of SNAP / CLIP-tag bevestigd aan de flexibele N- of C-terminus42,43. Alternatieve etiketteringsstrategieën zoals het invoegen van een onnatuurlijk aminozuur met een reactieve zijketen voor etikettering met een organische fluorofoor zijn de afgelopen jaren in opkomst44.
Voor dual-color PIE-FCS, waarbij alleen de interactie van twee interessante moleculen moet worden onderzocht, kunnen de fluoroforen worden geselecteerd uit een grote verscheidenheid aan gevestigde fluorescerende eiwitten of SNAP / CLIP-substraten. Hier zou het doel van spectroscopie moeten zijn om een paar zodanig te selecteren dat er weinig overspraak of directe acceptor-excitatie optreedt. Bovendien moeten de geselecteerde fluoroforen fotostabiel zijn en weinig of geen bleken vertonen onder de gekozen experimentele omstandigheden. Het wordt aanbevolen om fluoroforen in het rode spectrale bereik te selecteren, omdat (1) de autofluorescentieachtergrond van de cel wordt verminderd en (2) het excitatielicht een langere golflengte heeft, dus minder fototoxisch14. Fotobleaching kan worden geminimaliseerd door eerst een zogenaamde “power series” uit te voeren, waarbij het laservermogen stapsgewijs wordt verhoogd en de moleculaire helderheid wordt waargenomen. Het optimale excitatie-intensiteitsbereik ligt in het lineaire bereik van de resultaten45.
Als de twee labels ook moeten rapporteren over eiwitconformatiedynamiek via FRET, is de keuze van beschikbare fluoroforen beperkter. Hier moet de mogelijke minimale /maximale afstand tussen de twee fluoroforen vooraf worden geschat, bijvoorbeeld op basis van beschikbare structuren of moleculaire grootte, en een fluorofoorpaar geselecteerd met een redelijke Förster-straal R0, zodat FRET daadwerkelijk20kan voorkomen .
Hier werden eGFP en een SNAP-tag gekozen voor etikettering en de SNAP-tag werd gelabeld met een intracellulair of een membraan-ondoordringbaar oppervlaktesubstraat. De spectra zijn vergelijkbaar met die in figuur 2C-D. Deze combinatie van fluoroforen vertoont een hoge overspraak van de eGFP in de rode detectiekanalen en directe acceptor excitatie van het SNAP-substraat door de groene excitatie in het prompttijdvenster en resulteert in een significant “vals” signaal in de rode kanalen in het prompttijdvenster. Idealiter mogen beide waarden, cross talk en directe acceptor excitatie, niet hoger zijn dan 5%5,6,38. Met een Förster-straal van 57 Å is het echter bij uitstek geschikt om de afstand tussen de etiketten in de β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP-constructie te onderzoeken, zoals kan worden geëvalueerd op basis van de gebluste eGFP-levensduur (aanvullende aantekening 5).
Technisch gezien, zoals voor elk fluorescentiespectroscopie-experiment, moet het apparaat goed zijn uitgelijnd en geschikte excitatiebronnen, emissiefilter en gevoelige detectoren bezitten. Om te voorkomen dat artefacten van detector napulsing op de μs-tijdschaal, moeten ten minste twee detectoren van elke kleur aanwezig zijn, die kruisgecorreleerd kunnen zijn. In moderne tijdgecorreleerde elektronica voor het tellen van enkele fotonen speelt de dode tijd van de detectiekaart in het ns-tijdbereik nauwelijks een rol vanwege de onafhankelijke routeringskanalen, maar deze kan worden gecontroleerd zoals voorgesteld door Müller et al 16, op voorwaarde dat het tijdsbereik van belang ligt in het sub-μs / ns-tijdbereik. Bovendien moet voor nog hogere tijdresoluties in het ps-bereik elk detectiekanaal worden verdubbeld, d.w.z. dat er vier detectoren per kleur moeten worden gebruikt, om ook de dode tijden van de detector2,15,29,46te omzeilen. Hoewel de gemiddelde fluorescentielevensduur kan worden geschat met behulp van niet-gepolariseerde fluorescentiedetectie, moet voor analyse van de afstand (~ verdeling) tussen de fluoroforen de emissie polarisatieafhankelijk worden verzameld. Dit komt door het feit dat de efficiëntie van de energieoverdracht in FRET afhankelijk is van de oriëntatie van de twee fluoroforen. Meer gedetailleerde informatie vindt u hier20,28,47. Ten slotte is in OOB-experimenten de afstand tussen de prompt- en vertragingspuls van cruciaal belang en moet deze zodanig worden gekozen dat de fluorescentie-intensiteit van de fluoroforen grotendeels is vervallen (figuur 1B). Een gangbare regel is om de twee pulsen 5x de fluorescentielevensduur uit elkaar te plaatsen, d.w.z. voor eGFP met een fluorescentielevensduur van 2,5 ns moet de afstand 12,5 ns zijn bij minimaal22.
Na alle overwegingen voor de experimentele procedure te hebben uitgewerkt, worden de gegevens en de analyse ervan in meer detail besproken. Zoals vermeld in het protocolgedeelte, moet de uitlijning van de opstelling dagelijks worden gecontroleerd, inclusief de analyse van de kalibratiemetingen. De gegevens in figuur 2A-C tonen bijvoorbeeld een extra ontspanningscomponent in het bereik van 8-40 μs. Het is bekend dat het typische triplet knipperen van de groene kalibratiefluoofoor voorkomt in het bereik van 2-10μs 13,15,48. De langzame relaxatiecomponent die nodig is in alle curven van het DNA-monster(figuur 3C),te langzaam voor daadwerkelijk triplet knipperen, kan voortkomen uit interacties van het DNA met de fluoroforen39. Deze component zou echter niet worden verwacht in CCFPIEen komt hoogstwaarschijnlijk voort uit resterende overspraak. Het is daarom zeer raadzaam om de analyse van de kalibratiemonsters direct voorafgaand aan de celexperimenten uit te voeren om de kwaliteit van de uitlijning van de dag te beoordelen.
De juiste kalibratie van het confocale overlapvolume vereist een monster met 100% co-diffusie van het groene en rode label. Hier wordt fluorescerend gelabeld dubbelstrengs DNA gebruikt. Beide DNA-strengen kunnen worden aangepast om de gewenste fluoroforen op de vereiste afstand van elkaar te hebben. De ontworpen strengen kunnen met een hoog rendement worden gegloeid. Good Laboratory Practice adviseert echter om de integriteit en etiketteringsgraad van de DNA-strengen te controleren door middel van agarosegel-elektroforese en het meten van het absorptiespectrum. Ook moet de opbrengst van de dubbelstrengs assemblage worden gecontroleerd, omdat deze kalibratiemeting kritisch afhankelijk is van de veronderstelling dat er een 100% co-diffusie van het groen is met het rode label. In het geval dat de veronderstelling niet geldig is, moeten mogelijk correctiefactoren worden toegepast16,22. Bij de kalibratiemetingen in figuur 2 es figuur 3werd een detectievolume van respectievelijk 1,4 fL en 1,9 fL in het groene en rode kanaal verkregen. Dit verschil in grootte wordt verwacht voor een opstelling met bijna diffractie-beperkte excitatievolumes (aanvullende aantekening 2). Onder deze voorwaarde schaalt de grootte van het excitatievolume met de excitatiegolflengte. Dit verklaart op zijn beurt de verschillende correlatieamplitudes waargenomen in figuur 3B. De afgeleide correctiefactoren rGR = 0,56 en rRG = 0,72 corrigeren voor dit grootteverschil en potentiële niet-perfecte overlap van de twee excitatievolumes3,4.
Figuur 4, figuur 5, figuur 6es figuur 7 tonen de workflow van een op PIE-F(C)CS gebaseerde studie gericht op het begrijpen van conformatie-eiwitdynamica. Ten eerste dienen de twee enkelvoudig gelabelde constructies β2AR-IL3-eGFP en NT-SNAP-β2AR als controles om de fluorofooreigenschappen in cellen te karakteriseren in afwezigheid van de respectieve andere fluorofoor (Figuur 4). Vervolgens dient de dubbel gelabelde constructie NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP met een SNAP-tag naar de buitenkant van de cel en een eGFP aan de cytoplasmatische kant als een “100% co-diffusie” -controle(figuur 5). De laatste constructie, β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP, draagt beide fluoroforen aan de cytoplasmatische kant en dicht genoeg bij elkaar om FRET te ondergaan. Ook hier zou een 100% co-diffusie worden verwacht in combinatie met anti-gecorreleerde intensiteitsfluctuaties in het groene en rode kanaalsignaal in het prompte tijdvenster, d.w.z. na donorexcitatie, als gevolg van eiwitdynamiek die de FRET-efficiëntie beïnvloedt31,32,33. Deze dynamiek kan zich uiten als anticorrelatie in de CCFFRET (figuur 6-7).
Alle GPCR β2AR-constructies vertonen bimodale diffusie op het celmembraan(figuur 4A). Terwijl de β2AR-IL3-eGFP alleen het verwachte triplet knipperen laat zien (Figuur 5B)13,15, NT-SNAP-β2AR een extra langzame relaxatietijd ( Figuur5C-D). Het is waarschijnlijk dat tR2 afkomstig is van ongebonden SNAP-substraat. Dit kan worden opgehelderd door verdere experimenten, bijvoorbeeld door ook de diffusie en fotofysische eigenschappen van het gebruikte SNAP-substraat in een waterige oplossing te meten. Van belang is dat een eenvoudig experiment om onderscheid te maken tussen diffusie- en ontspanningstijden is om het gaatje van de confocale opstelling te veranderen, d.w.z. het effectieve volume te vergroten: terwijl de diffusietijden toenemen met toenemende effectieve volumes, zijn ontspanningsvoorwaarden ongewijzigd13. Houd er bij het bepalen van de concentratie fluorescerend eiwit (FP) op basis van de fit-resultaten rekening mee dat FP’s in het algemeen een rijpingsproces ondergaan, waarbij uiteindelijk de chromofoor wordt gevormd12. Deze rijpingstijd kan verschillen van FP tot FP naast fotofysica die afhankelijk is van de lokale chemische omgeving13,15. De werkelijke eiwitconcentratie in het door FCS gerapporteerde monster wordt dus meestal onderschat, wat kan worden gecorrigeerd als de fractie van niet-fluorescerende FP’s in het experiment kan worden bepaald. Ten slotte is het raadzaam om de fluorofoorspectra in levende cellen te controleren om de waarden voor α en δ te corrigeren, indien nodig, omdat de meeste fluoroforen gevoelig reageren op hun omgeving13,15,48. De achtergrond om af te trekken wordt bepaald door het signaal dat wordt verzameld in niet-getransfecteerde cellen. Bovendien moet de autocorrelatie van het respectieve andere kleurkanaal en de CCFPIE worden gecontroleerd om valse signalen te kunnen identificeren (aanvullende aantekening 4 – figuur 30).
De twee metingen van de NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP (Figuur 5D), waarbij de fluoroforen zich aan verschillende zijden van het membraan bevinden, werden op verschillende dagen verkregen en tonen het belang van statistieken in tijd-opgeloste single molecule fluorescentie. Hier kunnen de verschillende resultaten te wijten zijn aan de verschillende mate van etikettering: in de ene cel resulteerde de hogere mate van labeling en middeling van metingen in relatief weinig ruis (figuur 5B), terwijl van de andere cel slechts twee metingen konden worden verzameld (figuur 5A). Naast het verzamelen van voldoende gegevens, is het van cruciaal belang om de resultaten tijdig te evalueren en misschien de etiketteringsstrategie te optimaliseren. Bij het ontwerpen van de experimenten is het belangrijk om te onthouden dat FRET gevoelig is, maar beperkt tot afstanden tot 10 nm en anders “blind”. In ons geval wordt deze “blindheid” aangegeven door de ongewijzigde eGFP-fluorescentielevensduur (aanvullende aantekening 5). In de β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP-constructie(figuur 6A)kan FRET worden vastgesteld vanaf de uitgebluste eGFP-levensduur (aanvullende aantekening 5). Er wordt echter geen anticorrelatieterm waargenomen (figuur 6B), wat betekent dat FRET niet fluctueert of op een tijdschaal langzamer is dan de diffusietijd. Er zijn maximaal drie aanvullende versoepelingsvoorwaarden vereist in ACFgp, ACFrp, ACFrd es CCFFRET (Figuur 6C). De langzame component in ACFrp, ACFrd es CCFFRET kan te wijten zijn aan acceptorbleking en beïnvloedt natuurlijk de verkregen waarde van de langzame diffusie in deze curven (~ 350 ms vergeleken met 117 ms in ACFgp). tD in het rode kanaal wordt verondersteld iets groter te zijn dan in het groene kanaal vanwege de confocale volumes van verschillende grootte (figuur 2) – maar alleen met een factor die vergelijkbaar is met het grootteverschil. De zeer snelle relaxatietijd van 3 μs weerspiegelt het triplet knipperen van de fluoroforen13,15,48,terwijl de langzamere relaxatietijd van 37 μs te wijten kan zijn aan FRET: Evenzo, als FRET een anticorrelatie induceert in de CCFFRET,worden positieve correlaties verwacht in de autocorrelaties31,32,33. De aanwezigheid van deze term als “positief” in CCFFRET en de aanwezigheid ervan in de ACFrd kan worden verklaard met de hoge overspraak en moet verder worden opgehelderd. Merk op dat de CCFPIE vlak is op korte correlatietijden zoals verwacht.
Aan de andere kant moet worden opgemerkt dat het optreden van FRET in een interessant systeem leidt tot niet-lineaire effecten op de correlatiecurven6. De moleculaire helderheid van bijvoorbeeld een molecuul schaalt in de correlatie amplitude in het kwadraat en elke FRET-toestand (en de altijd aanwezige moleculen zonder actieve receptor) vertoont een andere moleculaire helderheid. INDERDAAD, FRET verlaagt de schijnbare concentratie van gedetecteerde groene moleculen (d.w.z. verhoogt de amplitude van ACFgp) en het aantal rode moleculen (bepaald aan de hand van rode prompt) wordt overschat5. Beide effecten beïnvloeden de hoeveelheid interactie afgeleid van zowel CCFFRET als CCFPIE. Globale analyse zoals bijvoorbeeld voor de intramoleculaire dynamica van Calmodulin 31 , 32of Syntaxin33 kan echter de eiwitdynamiek onthullen. Wanneer zorgvuldig gekalibreerd, kan de gemiddelde FRET-efficiëntie worden geëxtraheerd uit de relatieve CCFPIE en ACF-amplitudes22, terwijl de beperkende toestanden kunnen worden bepaald uit de analyse van de levensduurverdeling van donorfluorescentie33.
Gezien het feit dat in levende celexperimenten met grote fluoroforen zoals eGFP het FRET-contrast waarschijnlijk nog lager is dan wordt aangenomen voor de simulaties in figuur 6 en dat de directe excitatie van de acceptor niet in de simulatie is toegevoegd, zou dit kunnen verklaren waarom de identificatie van de anticorrelatie in levende celexperimenten zeer uitdagend is. Een veelbelovend analysealternatief is gebaseerd op het oogsten van de informatie die is gecodeerd in de histogrammen met de aankomsttijd van fotonen(figuur 1B)die toegankelijk zijn vanwege de tijdgecorreleerde gegevensverzameling van één foton29,30. Als de fluorescentielevensduur (~patronen) van de twee (of meer) (FRET) soorten in het monster bekend zijn(figuur 7A),kunnen “filter” of gewichten worden gekozen die tijdens het correlatieproces worden toegepast(figuur 7B)17,18,19. De aldus verkregen correlatiecurven vertegenwoordigen niet langer de correlatie van detectiekanalen, maar eerder de auto- of kruiscorrelaties tussen twee verschillende (FRET) soorten, dus omgedoopt tot species-ACF (sACF) of species-CCF (sCCF). Door deze benadering toe te passen op de gesimuleerde gegevens met matig FRET-contrast, hoge overspraak en triplet knipperen, wordt de anticorrelatieterm hersteld(figuur 7C-D). Er moet echter worden opgemerkt dat ontspanningstijden kunnen worden verkregen, maar de relatie met amplitude gaat verloren18. Deze benadering is eerder toegepast in experimenten met levende cellen, bijvoorbeeld om de interactie van EGFR met zijn antagonist49 te bestuderen of om de fluorescentie te scheiden van eiwitten die zijn gehecht aan eGFP-varianten met uitzonderlijk korte en lange fluorescentielevensduur50.
Terwijl PIE-gebaseerde FRET-metingen in gezuiverde eiwitten grotendeels worden gebruikt om eiwitdynamica3622te bestuderen, richt het zich in levende cellen op het begrijpen van eiwit-eiwitinteracties. Deze benadering is toegepast om de regulatie van MAP-kinaseactiviteit in gist51 te bestuderen of om de interactie van membraaneiwitten met hun cytosolische bindingspartner op te lossen zoals samengevat in dit recente artikel52. Hier kunnen complicaties optreden wanneer significante overspraak van groene fluoroforen nog steeds aanwezig is in het vertragingstijdvenster van de rode kanalen of rood signaal in de groene kanalen in het prompttijdvenster. De eerste kan worden veroorzaakt door een onvoldoende vertraging van de rode puls ten opzichte van de groene puls, terwijl beide effecten voortkomen uit te sterk overlappende excitatie- en emissiespectra van de gekozen fluoroforen. Het wordt aanbevolen om de respectieve enkel gelabelde constructies zorgvuldig te controleren en te corrigeren voor vals-positieve CCF PIE-amplitudes, vooral in cellen waar autofluorescentie met een zeer korte fluorescentielevensduur een andere complicerende factor22kan zijn .
Kortom, de HIER beschreven FRET-FCS-benadering heeft een groot potentieel om eiwit-eiwitinteracties en eiwitdynamiek in levende cellen bij bijna fysiologische concentraties te begrijpen. In dit protocol werd de nadruk gelegd op de benodigde kalibratiemetingen en de noodzakelijke kwantitatieve analyse die tijdens live cell metingen moest worden uitgevoerd. Hiertoe werden verschillende live celmetingen getoond, aangevuld met simulaties. De simulaties bieden hier het algemene inzicht, omdat de parameter systematisch kan worden gevarieerd met op maat gemaakte pasvormmodellen die de specifieke mobiliteit en fotofysische eigenschappen van de respectieve gegevens beschrijven. De analyse werd uitgevoerd met open-source softwaretools met een uitgebreid stap-voor-stap protocol en eenvoudig aan te passen sjablonen. Ten slotte zullen de technische vooruitgang, en dus de beschikbaarheid van kant-en-klare stabiele PIE-FCS-systemen samen met de verspreiding van open-source software voor data-analyse, deze techniek steeds toegankelijker maken voor een grotere onderzoeksgemeenschap om uiteindelijk eiwitinteractie en -dynamiek in levende cellen met de hoogste gevoeligheid te ontrafelen.
The authors have nothing to disclose.
Dit project werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, projectnummer 374031971, Project INF) aan J.B. en K.G.H.
We danken het Rudolf Virchow Center voor financiële steun en Core Unit Fluorescence Imaging voor technische ondersteuning. Daarnaast bedanken we Ashwin Balakrishnan voor het grondig proeflezen.
1x Telescope in 4f configuration with five lenses | Qioptiq, Rhyl, UK | G063126000 | Optics |
2x Band pass filters Brightline | AHF, Tübingen, Germany | HC 525/50 and HC 600/52 | Filter |
2x Dichroic beam splitter | AHF, Tübingen, Germany | HC BS F38-573 | Filter |
6-well culture plate Nunc | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 140675 | Reagent |
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20000 | Reagent |
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20003 | Reagent |
ASI stage PZ-2000 XYZ | Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany | WK-XYB-PZ-IX71 | Microscope Parts |
Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for 25 mm round coverslips | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A7816 | Glass coverslip holder |
Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14) | Laser Components GmbH, Olching, Germany | SPCM-AQR-14 | Single photon counting detector |
Beamsplitter | Newport, Darmstadt, Germany | 10FC16PB.3 | Filter |
Biorender (Software) | Science Suite Inc – o/a BioRender (Toronto, Canada) | — | Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/ |
Chinese hamster ovary (CHO) cell line | ATCC | CCL-61 | Cell lines |
ChiSurf (Data analysis Software) | Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA | — | tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017) |
Chloroform | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 472476-2.5L | Reagent |
DMSO | AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany) | A3672,0250 | Reagent |
DNA strand (40 bp fluorophore distance) | IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany) | — | Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’ |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | P04-41250, P04-41650 | Reagent |
Ethanol (absolute) | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 34852-1L-M | Reagent |
Erythrosin B,Dye content >=95 % | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 200964-5G | Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S 0615 | Reagent |
Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q | Excelitas Technologies, Ontario, Canada | XI120-Q-5060 | Microscope Parts |
Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9105S | Reagent |
Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549 | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9112S | Reagent |
Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 – 0.16 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 111640 | Reagent |
Laser Controller | Picoquant, Berlin, Germany | 910020 (PDL 828-S "SEPIA II") | Optics |
Laser lines (480 nm and 560 nm) | Picoquant, Berlin, Germany | 912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560) | Optics |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 11668-019 | Reagent |
MFD suite (Software) | AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany | — | Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis |
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | AC254-150-A-ML | Second part of Beam expander |
Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 640110 | Reagent |
Olympus IX 71 stand | Olympus, Hamburg, Germany | IX2-ILL100 | Microscope Parts |
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 31985-047 | Reagent |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 049M4857V | Reagent |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 14190144 | Reagent |
Pinhole (50 µM) | Newport, Darmstadt, Germany | PNH-50 | Pinhole |
PMT Hybrid-40 | Picoquant, Berlin, Germany | 932200 (PMA Hybrid 40) | Single photon counting detector |
Python scripts (Software) | Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany | — | Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS |
Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1) | AHF, Tübingen, Germany | F73-421PH | Filter |
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator | Picoquant, Berlin, Germany | 02126 | Optics |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 6771.1 | Reagent |
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software) | Picoquant, Berlin, Germany | 931073 (SPT64-1+2 single user ) | Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export |
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400 | Picoquant, Berlin, Germany | 930010 (Hydraharp 400) | Optics |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | T4299-100ml | Reagent |
Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 – 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | ACN127-020-A | First part of Beam expander |
Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W) | Olympus, Hamburg, Germany | UPLSAPO60XW | Objective |