Isolatie en cultuur van primaire menselijke gingivale epitheelcellen met behulp van Y-27632
Summary
Hier presenteren we een aangepaste methode voor de isolatie en kweek van menselijke gingivale epitheelcellen door de Rock-remmer, Y-27632, toe te voegen aan de traditionele methode. Deze methode is eenvoudiger, minder tijdrovend, verbetert de eigenschappen van stamcellen en produceert grotere aantallen epitheelcellen met een hoog potentieel, zowel voor het laboratorium als voor klinische toepassingen.
Abstract
Het gingivale weefsel is de eerste structuur die parodontale weefsels beschermt en een betekenisvolle rol speelt in veel orale functies. Het gingivale epitheel is een belangrijke structuur van gingivaal weefsel, vooral bij het herstel en de regeneratie van parodontaal weefsel. Het bestuderen van de functies van gingivale epitheelcellen heeft cruciale wetenschappelijke waarde, zoals het repareren van orale defecten en het detecteren van de compatibiliteit van biomaterialen. Omdat menselijke gingivale epitheelcellen sterk gedifferentieerde verhoornde cellen zijn, is hun levensduur kort en zijn ze moeilijk te passeren. Tot nu toe zijn er slechts twee manieren om gingivale epitheelcellen te isoleren en te kweken, een directe explantmethode en een enzymatische methode. De tijd die nodig is om epitheelcellen te verkrijgen met behulp van de directe explantmethode is echter langer en de celoverleving van de enzymatische methode is lager. Klinisch gezien is de verwerving van tandvleesweefsel beperkt, dus een stabiel, efficiënt en eenvoudig in vitro isolatie- en kweeksysteem is nodig. We verbeterden de traditionele enzymatische methode door Y-27632 toe te voegen, een Rho-geassocieerde kinase (ROCK) -remmer, die selectief de groei van epitheelcellen kan bevorderen. Onze aangepaste enzymatische methode vereenvoudigt de stappen van de traditionele enzymatische methode en verhoogt de efficiëntie van het kweken van epitheelcellen, wat aanzienlijke voordelen heeft ten opzichte van de directe explantmethode en de enzymatische methode.
Introduction
De menselijke gingiva, de eerstelijns verdedigingsstructuur die parodontaal weefsel beschermt, is niet alleen een fysieke en chemische barrière1, maar scheidt ook verschillende klassen van ontstekingsmediatoren af die deelnemen aan immuunresponsen en een immuunbarrière vormen2,3. Het gingivale epitheel speelt een belangrijke rol bij het herstel en de regeneratie van parodontaal weefsel. Daarom is het bestuderen van de verdediging en immuniteit van het gingivale epitheel van groot belang voor het begrijpen van het optreden, de diagnose en de behandeling van parodontitis. De isolatie en kweek van gingivale epitheelcellen uit menselijk gingivaal weefsel is de eerste stap die nodig is voor het bestuderen van het gingivale epitheel. Een dergelijke procedure vereist basisoperaties zoals het produceren van zaadcellen voor weefselmanipulatie, in vitro modellen van parodontale geassocieerde ziekten en materialen voor het repareren van parodontale defecten.
Primaire gingivale epitheelcellen worden gekenmerkt door een lage delingsgraad in vitro4, onderzoekers zijn al tientallen jaren op zoek naar een optimale isolatie- en teeltmethode. Tot op heden worden twee verschillende technieken, een directe explantmethode en een enzymatische methode, vaak gebruikt in laboratoria om primaire gingivale epitheelcellen in vitrote verkrijgen4,5. De directe explantmethode heeft voordelen zoals de vereiste van een lagere hoeveelheid weefselmonsters en een eenvoudige isolatieprocedure, maar heeft de nadelen van een langere kweektijd en gevoeligheid voor besmetting5. Hoewel de enzymatische methode de benodigde kweektijd verkort, is de efficiëntie relatief laag en varieert afhankelijk van de gebruikte enzymen en het gebruikte medium. Kedjarune et al.6 toonden aan dat de directe explantmethode, die meer tijd nodig heeft voor subcultuur (2 weken), succesvoller bleek te zijn voor het kweken van gingivale epitheelcellen in vergelijking met de enzymatische methode. Bij het vergelijken van deze twee methoden vonden Klingbeil et al.7 echter dat de enzymatische methode de beste resultaten had voor primaire culturen van orale epitheelcellen en dat het mogelijk was om de optimale celopbrengst te verkrijgen binnen de kortste tijdsperiode (11,9 dagen versus 14,2 dagen).
Daarom was het belangrijk om een handigere en effectievere methode te ontwikkelen voor de isolatie en kweek van orale epitheelcellen4. We hebben eerder gemeld dat het toevoegen van Y-27632, een remmer van Rho-geassocieerd eiwitkinase (ROCK), de isolatieprocedure van menselijke primaire epidermale cellen en keratinocyten uit volwassen huidweefselsvereenvoudigt 8,9,10. We ontwikkelden G-medium, een nieuw geconditioneerd inentingsmedium dat spontaan epidermale van dermale cellen scheidt en de groei en opbrengst van primaire epidermale cellenondersteunt 8,9,10. In de huidige studie ontwikkelden we een nieuwe serumvrije isolatie- en kweektechniek voor gingivale epitheelcellen door G-medium te combineren met Y-27632. In essentie is onze methode gebaseerd op een vereenvoudiging van de traditionele tweestaps enzymatische methode, dus hebben we onze nieuwe methode vergeleken met de directe explantmethode. Deze gemodificeerde enzymatische methode verkort aanzienlijk de tijd die nodig is om gingivale epitheelcellen te scheiden van gingivaal weefsel en verhoogt de efficiëntie van het kweken van gingivale epitheelcellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gingivale weefsel is een belangrijke structuur die parodontale integriteit en gezondheid handhaaft. Gingivale epitheelcellen spelen een belangrijke rol bij het herstel en de regeneratie van parodontaal weefsel en kunnen worden gebruikt in wetenschappelijk onderzoek en klinische toepassingen en aanverwante gebieden, waaronder orale biologie, farmacologie, toxicologie en mondslijmvliesdeficiënties18. Daarom is het noodzakelijk om een stabiele en efficiënte methode te ontwikkelen om orale epith…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Key Program van Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) en het Key Research and Development Program van de provincie Shandong (2019GSF108107) aan X.W.; het Key Research and Development Program van de provincie Shandong (2018GSF118240) aan J.G.; Medical and Health Science and Technology Development Project van de provincie Shandong (2018WS163) tot Z.X., en het Medical and Health Science and Technology Development Project van de provincie Shandong (2019WS045) tot J.S.
Materials
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
Referencias
- Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158 (2019).
- Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
- Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766 (2014).
- Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
- Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
- Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
- Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
- Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
- Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
- Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
- Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
- Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
- Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
- Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
- Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
- Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
- Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
- Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
- Smola, H., Krieg, T., Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. . The keratinocyte handbook. 375, 311 (1994).
- Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
- Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
- Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651 (2015).
- Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
- Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780 (2020).
- Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).
