Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Direkte og indirekte dyrkningsmetoder til undersøgelse af biologisk nedbrydelige implantatmaterialer in vitro

Published: April 15, 2022 doi: 10.3791/63065
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3
1Materials Science and Engineering Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Stem Cell Center, University of California, Riverside
* These authors contributed equally

Summary

Vi introducerer tre metoder til direkte dyrkning, direkte eksponeringskultur og eksponeringskultur til evaluering af in vitro-cytokompatibiliteten af biologisk nedbrydelige implantatmaterialer. Disse in vitro-metoder efterligner forskellige in vivo-celle-implantatinteraktioner og kan anvendes til at studere forskellige biologisk nedbrydelige materialer.

Abstract

I løbet af de sidste årtier er biologisk nedbrydelige materialer blevet grundigt udforsket til biomedicinske anvendelser såsom ortopædiske, dentale og craniomaxillofaciale implantater. For at screene biologisk nedbrydelige materialer til biomedicinske anvendelser er det nødvendigt at evaluere disse materialer med hensyn til in vitro-celleresponser , cytokompatibilitet og cytotoksicitet. International Organization for Standardization (ISO) standarder er blevet udbredt i evalueringen af biomaterialer. Imidlertid blev de fleste ISO-standarder oprindeligt etableret for at vurdere cytotoksiciteten af ikke-nedbrydelige materialer, hvilket gav begrænset værdi til screening af bionedbrydelige materialer.

Denne artikel introducerer og diskuterer tre forskellige dyrkningsmetoder, nemlig direkte dyrkningsmetode, direkte eksponeringskulturmetode og eksponeringskulturmetode til evaluering af in vitro-cytokompatibiliteten af bionedbrydelige implantatmaterialer, herunder bionedbrydelige polymerer, keramik, metaller og deres kompositter, med forskellige celletyper. Forskning har vist, at dyrkningsmetoder påvirker celleresponser på biologisk nedbrydelige materialer, fordi deres dynamiske nedbrydning inducerer spatiotemporale forskelle ved grænsefladen og i det lokale miljø. Specifikt afslører den direkte dyrkningsmetode reaktionerne fra celler, der er podet direkte på implantaterne; metoden med direkte eksponeringskultur belyser reaktionerne fra etablerede værtsceller, der kommer i kontakt med implantaterne og eksponeringskulturmetoden evaluerer de etablerede værtsceller, der ikke er i direkte kontakt med implantaterne, men påvirkes af ændringerne i det lokale miljø som følge af implantatnedbrydning.

Denne artikel giver eksempler på disse tre dyrkningsmetoder til undersøgelse af in vitro-cytokompatibiliteten af bionedbrydelige implantatmaterialer og deres interaktioner med knoglemarvsafledte mesenkymale stamceller (BMSC'er). Det beskriver også, hvordan man høster, passage, kultur, frø, fikserer, pletter, karakteriserer cellerne og analyserer postkulturmedier og materialer. De in vitro-metoder, der er beskrevet i denne artikel, efterligner forskellige scenarier i in vivo-miljøet og udvider anvendeligheden og relevansen af in vitro-cytokompatibilitetstest af forskellige biomaterialer til forskellige biomedicinske anvendelser.

Introduction

I årtier er biologisk nedbrydelige materialer blevet grundigt undersøgt og anvendt i biomedicinske applikationer såsom ortopædiske1,2, dental3,4 og craniomaxillofacial5 applikationer. I modsætning til permanente implantater og materialer nedbrydes biologisk nedbrydelige metaller, keramik, polymerer og deres kompositter gradvist i kroppen over tid via forskellige kemiske reaktioner i det fysiologiske miljø. For eksempel er biologisk nedbrydelige metaller såsom magnesiumlegeringer (Mg) legeringer1,6,7 og zink (Zn) legeringer8,9 lovende materialer til knoglefikseringsanordninger. Deres biologisk nedbrydelighed kan eliminere behovet for sekundære operationer for at fjerne implantaterne efter knogleheling. Bionedbrydelig keramik såsom calciumphosphatcementer (CPC'er) har vist et spændende potentiale til behandling af osteoporotiske vertebrale kompressionsfrakturer i perkutan kyphoplastik10. CPC'erne giver mekanisk støtte til den brækkede hvirvellegeme og nedbrydes gradvist, efter at bruddet er helet.

Bionedbrydelige polymerer, såsom nogle polysaccharider og polyestere, er også blevet bredt undersøgt til biomedicinske anvendelser. For eksempel har chitosanhydrogel som et biologisk nedbrydeligt polysaccharid udvist sine evner til at forhindre infektion og regenerere hudvæv11. Poly-L-mælkesyre (PLLA), poly(glycolsyre) (PGA) og poly(mælkesyre-co-glycolsyre) (PLGA) er bredt undersøgte polyestere til fremstilling af 2D eller 3D porøse stilladser til vævstekniske anvendelser12,13,14. Desuden integrerer kompositmaterialer to eller flere faser af metaller, keramik og polymerer for at levere avancerede funktioner til en bred vifte af biomedicinske applikationer15,16,17. For eksempel kan PLGA- og calciumphosphatkompositter bruges til at fremstille biologisk nedbrydelige stilladser til applikationer såsom reparation af kranieknogledefekter18. Disse biologisk nedbrydelige stilladser og implantater kan understøtte og fremme væksten af celler og væv og derefter gradvist nedbrydes i kroppen over tid.

Som vist i supplerende tabel 1 kan forskellige bionedbrydelige materialer have forskellige nedbrydningsmekanismer, produkter og hastigheder. For eksempel nedbrydes magnesiumlegeringer, såsom Mg-2 vægt % Zn-0,5 vægt % Ca (ZC21)1, Mg-4 vægt% Zn-1 vægt% Sr (ZSr41)19 og Mg-9 vægt% Al-1 vægt% zink (AZ91)20, ved at reagere med vand, og deres nedbrydningsprodukter omfatter hovedsageligt Mg2+ ioner, OH-ioner, H2-gas og mineralaflejringer. Nedbrydningshastigheden for bionedbrydelige metaller varierer afhængigt af deres forskellige sammensætninger, geometrier og nedbrydningsmiljøer. For eksempel rapporterede Cipriano et al.19, at ZSr41-ledninger (Ø1.1 × 15 mm) mistede 85% masse, mens rene Mg-ledninger med samme geometri mistede 40% masse efter at være blevet implanteret i rotteskinnebenet i 47 dage. Bionedbrydelige keramiske materialer såsom hydroxyapatit (HA) og β-tricalciumphosphat (β-TCP) kan nedbrydes via opløsningsdrevet ekstracellulær væskeopløsning eller nedbrydes til små partikler og derefter nedbrydes via både ekstracellulær væskeopløsning og cellemedierede resorptionsprocesser. Nedbrydningsprodukterne fra disse calciumphosphatbaserede keramik kan omfatte Ca2+-ioner, (PO4)3-ioner, OH-ioner og mineralaflejringer21. Nedbrydningshastigheden for calciumphosphatkeramik påvirkes signifikant af deres krystalstrukturer. For eksempel rapporterede Van Blitterswijk et al.22, at HA med 40 vol.% mikroporer ikke mistede nogen masse, mens β-TCP med 40 vol.% mikroporer mistede 30 ± 4% masse efter at være blevet implanteret i tibiae af kaniner i 3 måneder. Polymerer såsom PLGA14,23 kan nedbrydes på grund af hydrolyse af esterbindingerne i nærværelse af vand, og nedbrydningsprodukterne omfatter hovedsageligt mælkesyrer og glykolsyrer. Det kan tage en måned for PLGA 50/50 og flere måneder for PLGA 95/5 at opnå fuldstændig nedbrydning24.

Cellerespons og cytokompatibilitetstest er afgørende for at evaluere og screene disse biologisk nedbrydelige implantatmaterialer til biomedicinske anvendelser. Imidlertid blev de nuværende standarder fra Den Internationale Standardiseringsorganisation (ISO), såsom ISO 10993-5: 2009 "Biologisk evaluering af medicinsk udstyr-Del 5 Tests for in vitro cytotoksicitet", oprindeligt designet til at vurdere cytotoksiciteten af ikke-nedbrydelige biomaterialer såsom Ti-legeringer og Cr-Co-legeringer in vitro25. Specifikt dækker ISO 10993-5:2009 kun in vitro-cytotoksicitetstest af ekstraktet, direkte kontakt og indirekte kontakttest. I ekstrakttesten fremstilles ekstraktet ved at nedsænke prøver i ekstraktionsvæsker såsom kulturmedier med serum og fysiologiske saltopløsninger under en af standardtids- og temperaturbetingelserne. Det indsamlede ekstrakt eller fortynding tilsættes derefter i cellekulturen for at studere cytotoksicitet. For den direkte kontakttest opnås direkte kontakt mellem prøve og celler ved at placere testprøven på det etablerede (klæbede) cellelag. I den indirekte kontakttest pipetteres kulturmediet indeholdende serum og smeltet agar for at dække de etablerede celler. Prøven anbringes derefter på det størknede agarlag med eller uden filter.

ISO-standarderne har vist nogle begrænsninger, når de anvendes til at evaluere biologisk nedbrydelige materialer in vitro. I modsætning til ikke-nedbrydelige materialer er nedbrydningsadfærden for biologisk nedbrydelige materialer dynamisk og kan ændre sig på et andet tidspunkt eller under forskellige miljøforhold (f.eks. Temperatur, fugtighed, mediesammensætning og celletype). Ekstrakttesten evaluerer kun cytotoksiciteten af materialets nedbrydningsprodukter og afspejler ikke den dynamiske proces med nedbrydning af prøver. Både direkte og indirekte kontakttest af ISO-standarden karakteriserer kun interaktionerne mellem de etablerede celler og prøver. Desuden er materialerne og cellerne i den indirekte kontakttest i forskellige mikromiljøer, der ikke afspejler in vivo-miljøet og ikke fanger den dynamiske nedbrydning af bionedbrydelige materialer.

Formålet med denne artikel er at introducere og diskutere cytokompatibilitetstestmetoderne for forskellige bionedbrydelige implantatmaterialer for at imødegå de ovennævnte begrænsninger af de metoder, der er beskrevet i de nuværende ISO-standarder. De metoder, der præsenteres i denne artikel, overvejer implantatmaterialernes dynamiske nedbrydningsadfærd og de forskellige omstændigheder ved celle-materiale-interaktioner in vivo. Specifikt giver denne artikel tre cytokompatibilitetstestmetoder, nemlig direkte kultur, kultur med direkte eksponering og eksponeringskultur for forskellige bionedbrydelige materialer, herunder bionedbrydelige polymerer, keramik, metaller og deres kompositter til medicinske implantatapplikationer.

I den direkte dyrkningsmetode sås celler, der er suspenderet i dyrkningsmediet, direkte på prøverne, hvormed interaktionerne mellem nyfrøede celler og implantaterne evalueres. I den direkte eksponeringskultur placeres prøverne direkte på det etablerede cellelag for at efterligne interaktionerne mellem implantater og etablerede værtsceller i kroppen. I eksponeringskulturen placeres prøverne i deres respektive brøndindsatser og introduceres derefter til kulturbrøndene med etablerede celler, som karakteriserer de etablerede cellers reaktioner på ændringerne i det lokale miljø induceret af implantatnedbrydning, når de ikke har nogen direkte kontakt med implantater. Metoderne til dyrkning af direkte kultur og direkte eksponering evaluerer cellerne direkte eller indirekte i kontakt med implantatmaterialerne i samme kultur godt. Eksponeringskulturen karakteriserer cellerne indirekte i kontakt med implantatmaterialerne inden for en foreskrevet afstand i samme kulturbrønde.

Denne artikel præsenterer en detaljeret beskrivelse af cytokompatibilitetstesten for forskellige biologisk nedbrydelige materialer og deres interaktioner med modelceller, det vil sige knoglemarvsafledte mesenkymale stamceller (BMSC'er). Protokollerne omfatter høst, dyrkning, såning, fastgørelse, farvning og billeddannelse af cellerne sammen med analyser af postkulturmaterialer og medier, der gælder for en række biologisk nedbrydelige implantatmaterialer og en bred vifte af celletyper. Disse metoder er nyttige til screening af biologisk nedbrydelige materialer til forskellige biomedicinske anvendelser med hensyn til cellerespons og cytokompatibilitet in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of California at Riverside (UCR) til celle- og vævshøst. En 12 uger gammel kvindelig Sprague-Dawley (SD) rotte vises som et eksempel i videoen. Yngre hun- og hanrotter foretrækkes.

1. Forberedelse af cellekultur

BEMÆRK: De tre dyrkningsmetoder, der er beskrevet i denne artikel, er generelt anvendelige for forskellige celletyper, der er tilhængere. Her vil BMSC'er høstet fra rottevænninger blive introduceret som et eksempel til cellekulturforberedelse. Afhængigt af deres relevans for specifikke medicinske anvendelser kan forskellige celletyper anvendes, herunder primære celler høstet fra dyr eller humane donorer og cellelinjer fra en celle / vævsbank.

  1. Høstning af BMSC'er fra rottefravænninger
    BEMÆRK: Det skematiske diagram i figur 1 viser trinnene til høst af BMSC'er fra rotter fravænnede.
    1. Afliv Sprague Dawley (SD) rotten ved CO2-indånding .
    2. Fjern hud og muskler og bindevæv for at dissekere lårbenet ud af den aflivede rotte. Placer lårbensknoglerne i et 15 ml konisk rør (polypropylen) indeholdende cellekulturmedium. Placer de koniske rør på is indtil tidspunktet for udførelse af celleekstraktion.
      BEMÆRK: Tibia kan også bruges til at høste BMSC'er. Cellekulturmediet er Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (P/S).
    3. Overfør knoglerne til en petriskål i det biologiske sikkerhedsskab. Skær enderne af knoglen ved hjælp af et kirurgisk blad og skyl knoglemarven i et 50 ml konisk rør (polypropylen) ved at vaske knoglemarvshulrummet med cellekulturmedier ved hjælp af en sprøjte med en 251/2 G nål.
      BEMÆRK: Indsæt en sprøjte med en 18 G nål i medierne med knoglemarv. Tag langsomt og forsigtigt medierne op og dispenser for at bryde den store del af marven fra hinanden, indtil der ikke er synlige celle/vævsagglomerater til stede.
    4. Filtrer cellesuspensionen ved hjælp af et 70 μm filter efterfulgt af centrifugering ved 126 × g (1.000 o / min) i 5 minutter for at få cellepillerne.
    5. Aspirer supernatantmediet og genopfyld med 10 ml friske medier. Pipetter forsigtigt op og ned for at resuspend cellerne ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette.
    6. Pipette suspensionen direkte på indersiden af en T-75 kolbe og tilsæt medier for at bringe lydstyrken op til 25 ml. Dyrkning af cellerne i en inkubator i et standard sterilt cellekulturmiljø (dvs. 37 °C, befugtet atmosfære med 5 % CO2 og 95 % luft).
    7. Efter 3-7 dage skylles de ikke-adhængende celler væk ved at aspirere det gamle medium og genopfyldes med frisk medium. Fortsæt med at dyrke og fodre cellerne med frisk medium, indtil de er klar til cellepassage, frysning eller brug i et eksperiment.
  2. Vedligeholdelse af celler
    1. Skift cellekulturmediet regelmæssigt for at fjerne cellulære affaldsprodukter og genopfylde næringsstofferne ca. hver anden dag, indtil cellerne er 90% -100% sammenflydende. Ved 90% sammenløb, passage, frys eller brug cellerne i et eksperiment.
    2. Passerende celler
      BEMÆRK: Passaging, også kaldet subkulturering, er et udtryk, der gælder, når celler overføres fra en kultur til en anden. Friskhøstede celler er i passagestadium 0 (P0). Mængderne af trypsin-ethylendiamintetraeddikesyreopløsning (trypsin-EDTA) og medier beskrevet i denne artikel er for en T-75-kolbe.
      1. Kontroller cellerne under et optisk mikroskop for at bekræfte, at cellerne er 90% sammenflydende.
      2. Aspirere mediet fra cellekolben.
      3. 10 ml fosfatbufret saltvand (PBS) udleveres i kolben ved hjælp af en serologisk pipette. Ræk forsigtigt kolben for at skylle cellerne med PBS; aspirerer alle PBS.
        BEMÆRK: Dette trin fungerer som en ekstra skylning for at sikre, at ingen døde celler eller cellulært affald overføres under passaging.
      4. Dispenser 3 ml trypsin-EDTA i cellekolben direkte på overfladen af cellerne. Rock forsigtigt kolben for at sikre, at hele overfladen med cellerne er dækket af trypsin-EDTA.
      5. Cellekolben med trypsin-EDTA anbringes i inkubatoren i 5 minutter, så cellerne kan løsne sig.
      6. Efter 5 minutter i inkubatoren skal du kontrollere cellerne under et optisk mikroskop for at bekræfte, at cellerne løsnes. Hvis nogle celler ikke har løsnet sig, skal du trykke forsigtigt på siden af cellekolben og kontrollere kolben igen.
      7. Der tilsættes 9 ml frisk medium til cellekolben for at fortynde trypsin-EDTA. Dette giver mere tilgængelige proteiner for trypsin-EDTA at binde sig til i stedet for at lysere cellerne.
      8. Pipette cellerne ud i medier og trypsin-EDTA og dispensere dem i et 15 ml konisk rør. Centrifugering af cellerne ved 126 × g (1.000 o / min) i 5 minutter.
      9. Uden at forstyrre cellepillen, aspirere mediet med trypsin-EDTA.
      10. Tilsæt 5-10 ml friske medier til centrifugerøret og forsigtigt resuspend cellerne i mediet ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette.
      11. Pipette cellerne suspenderet i medium ud af centrifugerøret og opdele volumenet i 2-3 friske kulturkolber. Der tilsættes nok medium til at bringe det samlede mediumvolumen op på 25 ml for hver kolbe.
        BEMÆRK: Splitforholdet under subkultur kan variere afhængigt af celletyperne og specifikke vækstegenskaber.
      12. Kontroller cellerne under et optisk mikroskop og læg dem tilbage i inkubatoren.
    3. Frysning af celler
      1. Kontroller cellerne under et optisk mikroskop for at bekræfte, at cellerne er 90% sammenflydende.
      2. Gentag trin 1.2.2.2 til 1.2.2.9.
      3. Tilsæt 900 μL frisk medium til centrifugerøret med en 100-1000 μL mikropipette. Langsomt og forsigtigt resuspend celler i medium ved hjælp af den samme mikropipette.
      4. Overfør 900 μL-cellesuspensionen til en kryovial. Der tilsættes 100 μL dimethylsulfoxid (DMSO).
      5. Så hurtigt som muligt anbringes kryovialet i en cylindrisk skumbeholder designet til at regulere temperaturfald (se materialetabellen). Anbring skumbeholderen i -80 °C fryseren.
    4. Optøning af celler
      1. Tø de frosne celler op i vandbadet. Tag et sterilt 15 ml konisk rør fyldt med 5 ml frisk medium, læg cellerne i det koniske rør og centrifuger ved 126 × g (1.000 o / min) i 5 minutter.
      2. Aspirer det medium, der indeholder DMSO.
      3. Tilsæt 5-10 ml frisk medium til det 15 ml koniske rør af celler. Rør langsomt og forsigtigt op og ned for at resuspend cellerne.
      4. Pipette cellerne suspenderet i medium ud af 15 ml koniske rør og dispensere i en ny T-75 kolbe. Ved dispensering af celler skal du bruge en fejende bevægelse til at fordele cellerne så jævnt som muligt på bunden af cellekolben.
      5. Der tilsættes nok frisk medium til at bringe det samlede mediumvolumen op på 25 ml for hver T-75-kolbe.
      6. Kontroller cellerne under et optisk mikroskop, og anbring cellekolben tilbage i inkubatoren.

2. Prøveforberedelse og sterilisering

  1. Prøve forberedelse
    1. Brug vævskulturbehandlede plader som 6, 12, 24, 48 eller 96-brønds plader til cellekulturforsøg beskrevet i denne artikel. Vælg typen af vævskulturplader og mængden af medium i hver brønd baseret på forskellige eksperimentelle designs såsom prøvedimension.
  2. Steriliser eller desinficer alle de biologisk nedbrydelige prøver før cellekulturen.
    BEMÆRK: Desinfektion er acceptabel for in vitro undersøgelser, når prøverne er tilbøjelige til kemiske og/eller overfladeændringer under visse steriliseringsbetingelser, der involverer høj varme, oxidationsmiddel og/eller radikaler. Steriliserings- eller desinfektionsmetoder til forskellige prøvetyper varierer afhængigt af materialernes forskellige egenskaber, såsom polymerer, metaller og keramik. Processen til sterilisering eller desinfektion kan involvere varme, gas, stråling, kemikalier, højt tryk eller en kombination af disse.
    1. Bionedbrydelige metaller
      1. Generelt skal du bruge ultraviolet (UV) stråling til at desinficere biologisk nedbrydelige metaller til in vitro-undersøgelser .
        BEMÆRK: For eksempel rapporterede Zhang et al., at rene magnesium ( Mg) og ZC21 Mg legeringsprøver blev desinficeret under UV-stråling i 4 timer, før de blev anvendt i celleundersøgelserne1. For in vivo-undersøgelser kræves det generelt, at prøverne steriliseres. For mange biologisk nedbrydelige metaller såsom magnesium- eller magnesiumlegeringer bør autoklavering ved hjælp af damp undgås, fordi disse prøver kan oxideres eller korroderes i vand6. En kvartsskål anbefales til UV-desinfektion, fordi den giver bedre UV-gennemsigtighed end de fleste glas og plast.
      2. Steriliser Mg-legeringsprøver under tør varme i en ovn eller autoklave ved et temperaturområde på 100-200 °C.
        BEMÆRK: Da nogle metalliske legeringer stadig kan blive oxideret på overfladen ved høje temperaturer i luften, kan højintensitetsstråling i nogle tilfælde anvendes som et alternativ. Højintensitetsstråling såsom alfa- eller gammastråling bør dog undgås ved sterilisering af tynde metalfolier. Det kan forårsage atomforskydning i materialerne og ændre mikrostrukturen af materialer.
      3. Brug gassterilisering af ethylenoxid (EtO) som en alternativ metode til bionedbrydelige metaller, der er følsomme over for varme og stråling26.
    2. Bionedbrydelig keramik
      1. Desinficer generelt biologisk nedbrydelig keramik ved hjælp af UV-stråling eller 70% ethanolopløsning før in vitro-undersøgelser .
        BEMÆRK: For eksempel rapporterede Liu et al., at calciumphosphatprøverne blev desinficeret via nedsænkning i 70% ethanol i 1 time og eksponering for UV-lys i 12 timer på hver side, før de blev anvendt i in vitro-cytokompatibilitetstest27.
      2. Brug autoklaver til at sterilisere biologisk nedbrydelig keramik, hvis høj temperatur og vanddamp ikke beskadiger deres kompostioner og mikrostrukturer.
        BEMÆRK: Nogle keramik kan blive påvirket af autoklavering. For eksempel blev faseændring og overfladeruhed fundet, da yttria-stabiliseret zirconia keramik blev autoklaveret ved 121 ° C i 15 minutter. Derudover kan CPC'er ikke steriliseres via autoklavering med damp, fordi prøverne reagerer med vand.
      3. Brug alternative steriliseringsmetoder såsom Cobalt-60-stråling til ovennævnte yttria-stabiliserede zirconia keramik og CPC prøver28.
    3. Bionedbrydelige polymerer
      1. Generelt desinficeres bionedbrydelige polymerer ved hjælp af UV-stråling eller 70% ethanol, før de bruges i celleundersøgelser in vitro.
        BEMÆRK: Nogle polymerer kan undergå kemiske ændringer under UV-stråling. Til sterilisering kan gammastrålebehandling såsom Cobalt-60-stråling anvendes. For eksempel blev stivelsespulvere steriliseret under Cobalt-60-stråling, før de blev anvendt i in vitro-cellestudier29.
      2. Autoklave polymermaterialer, der kan modstå høj temperatur og fugt.
        BEMÆRK: For eksempel kan polymerer som polypropylen autoklaveres, da de kan tolerere autoklaveringstemperaturer (dvs. 121-134 ° C). Nogle polymerer såsom polycaprolacton (PCL) kan ikke autoklaveres på grund af deres relativt lave smeltepunkter (dvs. omkring 60 °C)30.
      3. Brug EtO-gas til at sterilisere polymere materialer, der er følsomme over for varme- eller strålingssterilisering.

3. Cellekultur metoder

  1. Direkte kultur metoder
    BEMÆRK: Det skematiske diagram i figur 2A viser trinnene i den direkte kulturmetode. I denne artikel blev BMSC'er dyrket på en Mg-afledt plade placeret inde i brøndene på en 12-brønds vævskulturbehandlet plade som et eksempel for at illustrere kulturmetoden.
    1. Følg trinnene beskrevet i trin 1.2.2.1-1.2.2.10 for at opnå cellesuspensionen.
    2. Brug en 90% sammenflydende kolbe til at bestemme cellekoncentrationen i cellesuspensionen ved hjælp af et hæmocytometer. Fortynd cellesuspensionen med frisk medium til en foreskrevet cellekoncentration, der er nødvendig for cellestudiet in vitro.
      BEMÆRK: Såningstætheden af celler bestemmes af det eksperimentelle design. For eksempel er celletætheder på 2.000-40.000 celler / cm2 blevet anvendt i forskellige celleundersøgelser med biologisk nedbrydelige materialer.
    3. Anbring prøverne (Mg-plade) i midten af de 12-brøndsbehandlede vævskulturplader. Skyl dyrkningspladerne sekventielt med 2 ml PBS og 2 ml DMEM for at kalibrere det osmotiske tryk under sterile forhold. Tilsæt 3 ml af den fortyndede cellesuspension i hver brønd på prøverne af interesse.
    4. Dyrkning af cellerne i en inkubator under standard cellekulturbetingelser i 24 timer.
      BEMÆRK: Kulturtiden kan være længere eller kortere end 24 timer afhængigt af det eksperimentelle design.
  2. Kulturer med direkte eksponering
    BEMÆRK: Det skematiske diagram i figur 2B viser trinnene i kulturen med direkte eksponering.
    1. Som beskrevet i trin 3.1.1 og 3.1.2 forberedes cellesuspensionen med de krævede koncentrationer af celler baseret på forsøgsdesignet for forskellige celletyper og tilsigtede anvendelser.
    2. Skyl dyrkningspladerne med 2 ml PBS og 2 ml DMEM sekventielt for at kalibrere det osmotiske tryk under sterile forhold. Tilsæt 3 ml af den fortyndede cellesuspension i hver brønd. Kultur cellerne i den befugtede inkubator under standard cellekulturbetingelser i 24 timer eller indtil cellerne når 50-80% sammenløb.
      BEMÆRK: Cellesammenløbsniveauet kan variere for forskellige celletyper og eksperimentelt design.
    3. Efter 24 timer skylles cellerne i brøndpladen med PBS ved hjælp af en pipette for at fjerne flydende døde celler.
    4. Anbring de desinficerede eller steriliserede prøver direkte på de klæbende celler. Tilsæt 3 ml frisk medium i hver brønd.
    5. Dyrkning af cellerne under standard cellekulturbetingelser i yderligere 24 timer.
      BEMÆRK: Kulturtiden kan være længere eller kortere end 24 timer afhængigt af det eksperimentelle design.
  3. Eksponeringskulturer
    BEMÆRK: Det skematiske diagram i figur 2C viser trinnene i eksponeringskulturmetoden.
    1. Indledende trin for cellepræparatet er de samme som eksponeringskulturen. Som beskrevet i trin 3.1.1 og 3.1.2 forberedes cellesuspensionen med de ønskede celler. I lighed med trin 3.2.1 og 3.2.2 frø cellerne i brøndpladen med den ønskede densitet og kultur dem i en inkubator under standard cellekulturbetingelser i 24 timer.
    2. Efter 24 timer skylles de klæbende celler med PBS for at fjerne flydende døde celler efterfulgt af tilsætning af 3 ml frisk medium i hver brønd.
    3. Derefter anbrings prøverne i brøndindsatserne med en membranporestørrelse på 0,4 μm og anbring brøndindsatserne med prøverne i hver brønd med cellerne.
    4. Dyrkning af cellerne under standard cellekulturbetingelser i yderligere 24 timer.
      BEMÆRK: Kulturtiden kan være længere eller kortere end 24 timer afhængigt af det eksperimentelle design.

4. Postkultur karakterisering af celler

BEMÆRK: For direkte dyrkning og direkte eksponeringskultur skal du rette, plette, afbilde og analysere cellerne klæbende på både brøndplader og prøver. Til eksponeringskultur analyseres cellerne, der klæbes til brøndpladerne.

  1. Cellefiksering
    1. Saml postkulturmediet fra hver brønd i et tilsvarende 15 ml konisk rør til yderligere analyse. Saml alle prøverne efter kultur til yderligere analyse.
    2. Skyl cellerne klæbende på både prøver og brøndplader 3 gange ved hjælp af PBS.
    3. Tilsæt 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA, 10% neutral bufferet formalin) i hver brøndplade. Sæt låget tilbage på brøndpladen og lad PFA'en reagere i 20 min.
    4. Efter 20 min. aspirerer PFA og udleverer den i en affaldsflaske. Skyl brøndpladen 3 gange med PBS til at fjerne PFA, og overfør affaldet til affaldsflasken.
  2. Cellefarvning
    1. Forbered arbejdslagrene for farvningsmidlerne efter fabrikantens anvisninger.
      BEMÆRK: For eksempel bruges Alexa Fluor 488 Phalloidin til at plette F-actin, og 4′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) bruges til at plette cellekerner. Farvningstiden kan reduceres, hvis prøverne nedbrydes hurtigt i farvningsopløsningerne.
    2. Tilsæt 200-400 μL fortyndet Alexa Fluor 488 Phalloidinfarvningsmiddel til hver brønd for at dække cellerne på brøndpladen og prøven. Pak brøndpladen ind i aluminiumsfolie for at forhindre lyseksponering, og lad Alexa Fluor 488 Phalloidin reagere i 20 minutter ved stuetemperatur.
    3. Saml Alexa Fluor 488 Phalloidin-farvningsmidlet, og dispenser det i den tilsvarende affaldsflaske. Skyl brøndpladen 3 gange med PBS for at fjerne det overskydende Alexa Fluor 488 Phalloidin, og dispenser den brugte PBS i den tilsvarende affaldsflaske.
    4. Tilsæt 200-400 μL fortyndet DAPI til hver brønd for at dække cellerne i brønden og på prøven. Pak brøndpladen ind i aluminiumsfolie, og lad DAPI'en reagere i 5 minutter ved stuetemperatur.
    5. Saml DAPI og dispenser den i den tilsvarende affaldsflaske. Skyl brøndpladen 3 gange med PBS for at fjerne DAPI'en, og dispenser den brugte PBS i den tilsvarende affaldsflaske.
  3. Celle billeddannelse
    1. Efter farvning skal du afbilde cellerne ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Når det er muligt, skal du tage fasekontrastbilleder af celler ud over fluorescensbilleder. Forestil dig cellerne på de bionedbrydelige prøver så hurtigt som muligt eller umiddelbart efter farvning for at undgå eller reducere mulige ændringer forårsaget af kontinuerlig nedbrydning af prøver. Opbevar cellerne i brøndpladerne i en bufferopløsning ved 2-8 °C efter fiksering, og aftryk cellerne så hurtigt som muligt efter farvning for at undgå tab af fluorescenssignaler.
    2. Ved direkte dyrkning og kultur med direkte eksponering afbildes og evalueres to typer celler: (1) cellerne på prøverne (i direkte kontakt med prøverne) og (2) cellerne, der klæber på brøndpladen omkring prøverne (indirekte kontakt med prøverne), som vist i figur 3A.
    3. For eksponeringskultur, som vist i figur 3B, skal du bruge en billedvejledning, når du tager fluorescensbilleder af celler for at bestemme, om celleresponsen ville være anderledes som reaktion på prøvernes dynamiske nedbrydningsgradient. Billede og analyser cellerne placeret i området inden for den indre ring (3,5 mm væk fra midten) og den ydre ring (7 mm væk fra midten) separat.
      BEMÆRK: Billedguiden bruges til at definere afstanden mellem cellerne og prøverne.
    4. For hver prøve og brønd i dyrkningspladerne udtages der tilfældigt mindst fem billeder fra hvert interesseområde, hvor cellerne enten er i direkte kontakt eller indirekte kontakt med prøverne i en foruddefineret afstand.
  4. Billede analyse
    1. For alle cellebilleder opnået fra trin 4.3 kvantificeres cellemorfologien ved at måle cellespredningsområdet og billedformatet ved hjælp af software som ImageJ til billedanalyse.
    2. Tæl antallet af celler i hvert billedområde. Beregn celleadhæsionstætheden under direkte og indirekte kontaktbetingelser som antallet af celler pr. Arealenhed.

5. Postkulturanalyser af medier og prøver

  1. Mål pH i postkulturmediet.
    BEMÆRK: Nogle prøver ændrer mediets pH-værdi under deres nedbrydning. For eksempel øger bionedbrydelige metaller såsom magnesiumlegeringer normalt mediumets pH-værdi på grund af deres nedbrydning31. I modsætning hertil reducerer bionedbrydelige polymerer som PLGA ofte mediets pH-værdi, når de nedbrydes32. Måling af pH-værdien af postkulturmediet kan indikere nedbrydningen af disse prøver in vitro.
    1. Før cellefiksering indsamles postkulturmediet som i trin 4.1.1.
    2. Mål pH-værdierne for postkulturmediet i hver brønd umiddelbart efter indsamling ved hjælp af en forkalibreret pH-meter.
      BEMÆRK: Mediets pH kan drive over tid på grund af miljøforhold som CO2-niveau og temperatur, hvilket bør tages i betragtning.
  2. Analyser mediumsammensætningerne for nedbrydningsadfærd af biologisk nedbrydelige prøver. For nogle prøver, der forårsager en farveændring af mediet, måles den optiske densitet (O.D.) værdi af postkulturmediet ved hjælp af et spektrofotometer eller en mikropladelæser for at bestemme nedbrydningsadfærden. Alternativt kan du bruge ultraviolet-synlig spektroskopi (UV-VIS) og Fourier transformere infrarød spektroskopi-svækket total reflektion (FTIR-ATR) til at analysere nedbrydningsprodukterne i postkulturmediet.
    BEMÆRK: Måling af nedbrydningsprodukterne i postkulturmediet er værdifuldt for at forstå prøvernes nedbrydningsadfærd. En af de mest almindelige tilgange er at måle ionerne af interesse for postkulturmediet ved hjælp af et induktivt koblet plasma-optisk emissionsspektrometer (ICP-OES). ICP-OES kan bruges til at måle sammensætningen af postkulturmediet af metaller og keramik, men er muligvis ikke egnet til polymerer. Polymerer består normalt af kulstof, hydrogen og ilt, og nøjagtig kvantificering af disse elementer er vanskelig for ICP-OES.
    1. Efter trin 5.1.2 til pH-måling opsamles og fortyndes mediet ved hjælp af en ønskelig fortyndingsfaktor for optimale målinger af ionkoncentrationer.
    2. Mål koncentrationerne af ioner af interesse for postkulturmediet ved hjælp af en ICP-OES.
  3. Postkultur analyse af prøver
    BEMÆRK: Efter in vitro-celleundersøgelse kan de biologisk nedbrydelige prøver ændre sig i dimension, masse, overflademorfologi, mikrostruktur og sammensætning. Postkulturanalyse af prøver hjælper med at forstå nedbrydningsmekanismen for prøver.
    1. Efter cellekultur skal du tage fotografierne af prøverne for at vise mulige ændringer i prøvedimension, farve, morfologi og andre synlige egenskaber.
    2. Tør eller dehydrer postkulturprøverne, og mål prøvens masse, dimension og volumen for at kvantificere eventuelle ændringer i masse, dimension og volumen.
    3. Brug et scanningselektronmikroskop (SEM) til at karakterisere prøvernes mikrostruktur og morfologi. Brug energidispersiv røntgenspektroskopi (EDX) og røntgendiffraktion (XRD) til at karakterisere sammensætningen og fasen af nedbrydningsprodukterne på prøverne. Brug FTIR-ATR til at detektere den kemiske binding på prøveoverfladerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 4 viser de repræsentative fluorescensbilleder af BMSC'er under direkte og indirekte kontaktbetingelser ved hjælp af forskellige dyrkningsmetoder. Figur 4A,B viser BMSC'erne under direkte og indirekte kontaktbetingelser efter den samme 24 timers direkte dyrkning med ZC21-magnesiumlegeringer1. ZC21-legeringerne består af 97,5 vægt% magnesium, 2 vægt% zink og 0,5 vægt% calcium. De celler, der ikke har nogen direkte kontakt med ZC21-legeringsprøverne, spredes bedre end dem, der har direkte kontakt med prøverne. Som vist i figur 4C,D udviser cellerne under direkte og indirekte kontaktbetingelser alle normal morfologi efter en 24 timers direkte eksponering med hyaluronsyre (HyA) hydrogeler, der er tværbundet af Fe3+ ioner. Antallet af celler under betingelsen om indirekte kontakt er dog lavere end under betingelsen om direkte kontakt33. En anden undersøgelse rapporterede virkningerne af nedbrydning af ZSr41-legeringer (ф = 1,1 mm) på BMSC'er efter en 24 timers eksponeringskultur19. ZSr41-legeringerne består af 95 vægt% magnesium, 4 vægt% zink og 1 vægt% strontium. Figur 4E viser de repræsentative fluorescensbilleder af BMSC'er, der klæber til kulturbrønden på et sted 3,5 mm væk fra brøndcentret efter en 24 timers eksponeringskultur med de biologisk nedbrydelige stifter19.

Figur 5 viser eksempeldataene for kvantificeret celleadhæsionstæthed. Som vist i figur 5A har BMSC'er i direkte kontakt med ZC21 i 24 timers direkte eksponeringskultur (24h_DE) signifikant større celleadhæsionstæthed end nogen anden gruppe. I den direkte 24-timers kultur (24h_D) viser BMSC'er i direkte kontakt med ZC21 signifikant højere celleadhæsionstæthed end Mg-gruppen, signifikant lavere end Glasreferencegruppen, men ingen statistisk forskel sammenlignet med Ti-legeringen (T64) -kontrollen. Som vist i figur 5B er BMSC-vedhæftningstætheden signifikant højere for ZC21-gruppen end Mg-gruppen i den indirekte kontaktbetingelse for kultur med direkte eksponering. Det viser imidlertid ingen signifikant forskel sammenlignet med T64- og cellekontrolgrupperne. I den indirekte kontakttilstand for direkte dyrkning er BMSC-vedhæftningstætheden signifikant højere for ZC21-gruppen end for Mg-gruppen, men viser ingen signifikant forskel sammenlignet med T64- og cellekontrolgrupperne1.

Figur 6A viser pH-værdien af postkulturmediet efter den direkte eksponeringskultur og direkte kultur. For kulturen med direkte eksponering varierer pH-værdierne for mellemlangt fra 8,3 til 8,4 for alle prøver. I den direkte kultur varierer pH-værdierne for medium fra 7,9 til 8 på tværs af grupperne. Figur 9B viser Mg2+ ionkoncentrationen i postkulturmediet. I både den direkte eksponeringskultur og den direkte kultur er Mg2+-ionkoncentrationerne i ZC21- og Mg-grupperne signifikant højere end i nogen anden kontrolgruppe1. Figur 7 viser XRD-mønstrene for ZSr41 og ren Mg efter en 3-dages eksponeringskultur. I figur 7A findes de krystallinske faser af Mg, Ca(OH)2, ZnO, MgO∙H2O, Ca(HPO4)(H2O)2 og Ca5(PO4)3(OH) (dvs. hydroxyapatit eller HA), Mg17Sr2 på overfladen af ZSr41. I figur 7B er de krystallinske faser af Mg, Ca(OH)2, Mg3(PO4)2, Mg7(PO4)2(OH)8, Ca2P2O7∙5H2O på overfladen af ren Mg19. Figur 8A viser overlejringen af SEM-billeder og EDX-kort over overfladeelementær sammensætning for MgO-belagt Mg og kontrol af Mg-substrater og glas efter 24 timers direkte kultur med BMSC'er. Figur 8B viser den kvantitative overfladeelementariske sammensætning af prøvefladerne, hvilket indikerer forskellige aflejringer dannet under cellekultur34.

Figure 1
Figur 1: Skematisk diagram, der viser trinnene til høst af BMSC'er fra rottevænninger. Dette tal er ændret fra 35. Forkortelse: BMSC'er = knoglemarvsafledte mesenkymale stamceller. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skematisk diagram, der viser de tre cellekulturmetoder. (A) Direkte kultur, (B) direkte eksponeringskultur og (C) eksponeringskultur. Dette tal er ændret fra 36. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Skematiske diagrammer, der viser direkte kultur og kultur med direkte eksponering. (A) Celler under direkte kontakt og indirekte kontaktbetingelser i direkte kultur og direkte eksponeringskultur. (B) Anvendelse af en billeddannelsesvejledning til at tage billeder af cellerne, der klæbes til brøndpladen i forskellige afstande væk fra midten af prøverne i eksponeringskultur. Figur 3B er ændret fra 37. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative fluorescensbilleder af BMSC'er. (A, B) Direkte og indirekte kontaktbetingelser efter en 24 timers direkte dyrkning med ZC21-legeringer. (C, D) Direkte eksponeringskultur med HyA-hydrogeler. (E) På dyrkningspladen efter en eksponeringskultur på 24 timer med ZSr41-legeringer. Skalastænger = 100 μm. A og B gengives fra 1; C og D er gengivet fra 33; og E er gengivet fra 19. Forkortelser: BMSC'er = knoglemarvsafledte mesenkymale stamceller; HyA = hyaluronsyre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Kvantitative resultater for BMSC'ers celleadhæsionstæthed. (A) Direkte kontakt og (B) indirekte kontaktbetingelser efter 24 timers direkte eksponeringskultur (24 h_DE) og direkte kultur (24 h_D). Dette tal er gengivet fra 1. Forkortelser: BMSC'er = knoglemarvsafledte mesenkymale stamceller; DE = kultur med direkte eksponering D = direkte kultur. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Repræsentative resultater for postkulturanalyser af medium efter 24 timers direkte eksponeringskultur og direkte kultur. (A) pH-værdier og (B) Mg2+ ionkoncentrationer. Dette tal er gengivet fra 1. Forkortelser: DE = kultur med direkte eksponering; D = direkte kultur. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Repræsentative postkulturresultater for faseanalyser af bionedbrydelige metalliske prøver efter 3 dages dyrkning med BMSC'er. (A) Røntgendiffraktionsspektrum for ZSr41. (B) XRD-spektrum for ren Mg. Dette tal er gengivet fra 19. Forkortelser: BMSC'er = knoglemarvsafledte mesenkymale stamceller; XRD = Røntgendiffraktion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Repræsentative postkulturresultater for overfladeanalyser af prøver efter 24 timers direkte dyrkning med BMSC'er, herunder overflademikrostruktur, morfologi og sammensætning. (A) Overlejring af SEM-billeder og EDX-kort over overfladeelementær sammensætning for MgO-belagt Mg., ikke-belagt Mg-kontrol og glasreference. B) Overfladeelementær sammensætning (at. %) kvantificeret ud fra EDX-analyser. Skalastænger = 200 μm. Gengivet fra 34. Forkortelser: BMSC'er = knoglemarvsafledte mesenkymale stamceller; SEM = scanning elektronmikroskopi; EDX = energidispersiv røntgenspektroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende tabel 1: Nedbrydningsmekanismer, produkter og satser for forskellige typer materialer og de resultater, der er indsamlet til postkulturprøven og mediumanalysen. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forskellige cellekulturmetoder kan anvendes til at evaluere in vitro-cytokompatibiliteten af biomaterialer af interesse for forskellige aspekter af applikationer in vivo. Denne artikel demonstrerer tre in vitro-dyrkningsmetoder, dvs. direkte kultur, kultur med direkte eksponering og eksponeringskultur, for at efterligne forskellige in vivo-scenarier, hvor bionedbrydelige implantatmaterialer anvendes inde i menneskekroppen. Den direkte dyrkningsmetode bruges hovedsageligt til at evaluere opførelsen af nyfrøede celler, der direkte klæber til og omgiver implantatmaterialerne. Metoden til dyrkning af direkte eksponering efterligner in vivo-scenariet, hvor implantatmaterialerne kommer i direkte kontakt med de etablerede celler og væv. Eksponeringskulturmetoden kan bruges til at vise, hvordan nedbrydningsprodukterne fra implantatmaterialerne og ændringerne i det lokale mikromiljø kan påvirke de etablerede celler og væv, der ikke er direkte i kontakt med implantatmaterialerne.

I den direkte kultur vurderes de nyfrøede celler under både direkte og indirekte kontaktbetingelser. I kulturen med direkte eksponering kan etablerede celler evalueres under både direkte og indirekte kontaktbetingelser. I eksponeringskulturen kan kun etablerede celler under indirekte kontaktbetingelser evalueres. De nyfrøede celler under direkte kontaktbetingelser i den direkte kultur påvirkes af materialeegenskaber og materialeinducerede ændringer i medium, såsom ændringer i ionkoncentration og pH-værdi.

Ovennævnte materialeegenskaber kan omfatte overflademorfologi, hydrofilicitet, overfladefri energi, stivhed og sammensætning. De nyfrøede celler under indirekte kontaktbetingelser i metoden med direkte dyrkning og alle de etablerede celler i dyrknings- og eksponeringskulturmetoderne påvirkes hovedsageligt af materialeinducerede ændringer i mediet. De tre forskellige metoder, der er beskrevet i denne artikel, er tættere på det praktiske scenario i in vivo-miljøet end konventionelle metoder såsom mediumekstraktmetoden. Mediumekstraktmetoden evaluerer kun cytotoksiciteten af materialets nedbrydningsprodukter og afspejler ikke den dynamiske proces med nedbrydning af prøver. I de dyrkningsmetoder, der er beskrevet i denne artikel, kan den dynamiske ændring af de biologisk nedbrydelige materialer og det mellemstore miljø påvirke cellerne in situ, da cellerne dyrkes med implantatmaterialerne.

Selv om ingen in vitro-undersøgelser helt kan erstatte in vivo-undersøgelser , supplerer in vitro-undersøgelser og kan give værdifulde data på en billig og effektiv måde. In vivo-undersøgelser omfatter normalt alle flere variabler i en model, mens in vitro-cellekultur kan studere virkningerne af en enkelt faktor på celle-materiale-interaktioner. De metoder, der introduceres i denne artikel, kan efterligne forskellige scenarier i de relevante in vivo-undersøgelser . Vi kan skabe sammenhænge mellem forskellige variabler for at give kosttilskud til in vivo-undersøgelser . En in vivo-model indeholder normalt kun det samme væv i en dyretype. Imidlertid kan in vitro-undersøgelser omfatte forskellige celletyper i en kultur, som kan studere de kombinerede virkninger af forskellige variabler på celle-materialeinteraktioner. Desuden er det relativt vanskeligt at studere virkningerne af dynamiske miljøændringer på celle-materiale-interaktioner i in vivo-modeller . De metoder, der er beskrevet i denne artikel, kan undersøge virkningerne af dynamiske ændringer såsom ionkoncentrationer i mediet på celleadfærd38.

Metoderne i denne artikel kan anvendes til at forstå in vitro-cytokompatibilitet af alle typer materialer, herunder polymerer, metaller, keramik, kompositter og nanopartikler, og bestemme deres interaktioner med forskellige celler, bakterier eller svampe baseret på de tilsigtede anvendelser. For eksempel evaluerede Xu et al. in vitro-cytokompatibiliteten af HyA-baserede hydrogeler med BMSC'er via metoden med direkte eksponeringskultur33. Celleadhæsionstætheder og cellemorfologier blev analyseret under direkte og indirekte kontaktbetingelser. Cytotoksiciteten af HyA-baserede hydrogelkompositter kan være relateret til koncentrationerne af Fe3+ og H + ioner frigivet fra de tværbundne HyA-hydrogeler under cellekultureksperimentet. Tian et al. dyrkede humane urothelceller (HUC'er) med fire forskellige Mg-legeringer i 24 timer og 48 timer ved hjælp af eksponeringskulturmetoden og deres uopløselige nedbrydningsprodukter af MgO og Mg (OH)2 i 24 timer ved hjælp af direkte eksponeringskultur til at undersøge cytokompatibilitet og nedbrydningsadfærd af Mg-legeringer indeholdende zink (Zn) og strontium (Sr) til potentiel ureteral stentanvendelse39 . I denne undersøgelse viste det sig, at ZSr41_B indeholdende 4 vægt% Zn og 0,5 vægt% Sr havde bedre cytokompatibilitet med HUC'er blandt alle de andre Mg-4Zn-xSr-legeringer i både 24 timers og 48 timers eksponeringskulturer. Resultaterne viste også, at der ikke blev fundet synlige klæbende celler på brøndpladen, når koncentrationerne af magnesiumoxid (MgO) og magnesiumhydroxid (Mg(OH)2) oversteg 1,0 mg/ml efter 24 timers direkte eksponeringskultur. Derfor konkluderede Tian et al., at det er nødvendigt at reducere nedbrydningshastighederne for Mg-legeringer for at kontrollere de mulige bivirkninger mod fremtidig klinisk oversættelse. Wetteland et al. skabte en polymerbaseret nanokomposit ved at dispergere hydroxyapatit (nHA) og nMgO nanopartikler i en biologisk nedbrydelig PLGA-polymer40. Denne nanokomposit blev undersøgt ved dyrkning af BMSC'er med forskellige prøver ved hjælp af den direkte dyrkningsmetode. Resultaterne viste, at forbedret dispersion af nanopartikler i polymeren kunne forbedre BMSC-vedhæftningen på nHA / PLGA, men reducere cellelevedygtigheden på nMgO / PLGA. Baseret på resultaterne af in vitro-celleundersøgelser rapporterede Wetteland et al. værdifuld indsigt for at konstruere optimale keramiske / polymernanokompositter til forskellige biomedicinske anvendelser.

Cellemorfologier og celletal kan observeres og kvantificeres i fluorescensbilleder ved hjælp af software til kvantitativ billedanalyse såsom ImageJ. Vi kan undersøge virkningerne af forskellige materialer på celleadhæsion og morfologi ved at kvantificere celleadhæsionstæthederne, celleformatforhold og cellespredningsområder for forskellige prøvegrupper. Morfologien af celler fra den blindprøvede kontrolgruppe, hvor kun cellerne dyrkes i medium, kan tjene som referencestandard uden nogen indflydelse fra prøvematerialer. Vi kan bestemme, om prøvematerialerne vil påvirke celleadhæsion og morfologi in vitro ved at sammenligne celleadhæsionstæthederne og cellemorfologierne i prøvegrupperne med dem i den tomme kontrol. Cellespredningsområdet afslører præferencen for celleadhæsion til prøveoverfladen og viser, hvordan cellerne interagerer med prøvematerialerne. I denne artikel reducerede vi reaktionstiden for DAPI-farvning til at være mindre end den leverandøranbefalede optimale tid, fordi biologisk nedbrydelige prøver, såsom rent magnesium, nedbrydes hurtigt i vandige opløsninger. Morfologien af celler, der klæbes til de biologisk nedbrydelige materialer, kan ændre sig, hvis farvningsprocessen tager for lang tid, og vandeksponeringstiden er for lang for prøverne. For de celler, der klæber til biologisk nedbrydelige materialer, bør der desuden straks tages cellebilleder for at reducere eventuelle ændringer i celleadhæsion og morfologi på grund af nedbrydning af prøver.

Udover at indsamle resultater af celler er postkulturmedie- og prøveanalyser vigtige, fordi de vil give værdifulde data til analyse af nedbrydningsmekanismen, produkterne og hastigheden af implantatmaterialerne. For eksempel kan bionedbrydelige polymerer såsom PLGA generere sure nedbrydningsbiprodukter såsom monomere eller oligomere hydroxylcarboxylcarboxylsyrer under cellekulturen32, hvilket kan påvirke cellevækst og proliferation. I modsætning hertil producerer bionedbrydelige metaller, såsom magnesium og dets legeringer, hydroxidioner og hydrogengas under deres nedbrydning31, hvilket kan øge den lokale pH betydeligt, og alvorlig alkalinitet kan have negative virkninger på lokale cellefunktioner. Forskellige bionedbrydelige keramikkeramikker kan også øge pH-værdien i mediet41. Generelt kræver celler et specifikt pH-interval i dyrkningsmediet for at fungere korrekt, og det er kendt, at øgede eller nedsatte pH-værdier i kropsvæsker er skadelige for livet42. Måling af pH i postkulturmediet er værdifuldt for at forstå enhver potentiel skade, som biologisk nedbrydelige prøvematerialer kan forårsage i cellekultur. Derfor er det nødvendigt at måle pH-værdien af postkulturmediet for at forstå de potentielle mekanismer for, hvordan disse biologisk nedbrydelige materialer påvirker celler.

Det er vigtigt at måle de afgørende ionkoncentrationer i postkulturmediet for bionedbrydelige materialer. For eksempel målte Cortez Alcaraz et al. Mg2+ og Ca2+ ionkoncentrationerne af postkulturmediet, da de studerede magnesiumoxid nanopartikelbelagte magnesiumprøver ved hjælp af direkte kultur med BMSC'er34. Koncentrationerne af magnesiumioner indikerer nedbrydningsegenskaberne af forskellige prøver in vitro under cellekultur, og koncentrationerne af calciumioner kan give information om calciumaflejring under celleproliferation. Xu et al. målte Fe3+ ionkoncentrationer af postkulturmediet, da de studerede HyA-hydrogeler ved hjælp af direkte eksponeringskultur med BMSC'er. De brugte Fe3+ ioner til at justere tværbindingstæthederne af HyA33. Fe3+ ioner kan nedsætte pH-værdien af dyrkningsmediet, og høje koncentrationer af Fe3+ ioner kan være giftige for cellerne. Derfor er det vigtigt at måle koncentrationerne af de ioner, der er af interesse, for at forbedre cytokompatibiliteten af bionedbrydelige materialer og deres tilknyttede nedbrydningsprodukter.

Vi kan indsamle forskellige data for at analysere celle-materiale-interaktioner for forskellige materialer. For eksempel, som vist i supplerende tabel 1, nedbrydes Mg-legeringer ved at reagere med vand, og nedbrydningsprodukterne kan omfatte Mg2+ og OH-ioner , H2-gas og nogle andre uopløselige nedbrydningsprodukter såsom Mg (OH)2. XRD, SEM og EDX, som kunne bruges til at bestemme mineralaflejringen dannet på materialet. Vi kan studere virkningerne af koncentration af Mg2+ ioner og pH-værdier i medium på celleadfærd. Desuden kan vi bruge disse resultater til at studere gasudviklingen under metalnedbrydning. In vitro-undersøgelser har rapporteret, at det kritiske toleranceniveau for H2-gas er <0,01 ml /cm2/dag, og dette er blevet anvendt i vid udstrækning til at screene magnesiumlegeringer til midlertidige implantatapplikationer. I det væsentlige er mængden af gasudvikling afhængig af nedbrydningshastigheden af magnesiumlegeringerne. I et andet eksempel nedbrydes PLGA på grund af hydrolyse af dets esterforbindelser i nærværelse af vand. Nedbrydningsprodukterne af mælkesyre og glykolsyre samt pH-værdierne i mediet kunne undersøges for at analysere celle-materiale-interaktioner. De metoder, der er beskrevet i denne artikel, omfatter måling af frigivne ioner og pH-værdierne i cellekulturmedierne og masseændringen af materialerne, som kan bruges til at estimere nedbrydningshastigheden af materialerne.

Forskellige materialer opfører sig normalt forskelligt in vitro og in vivo, og metoderne til cytokompatibilitetsundersøgelser bør vælges ud fra applikationsmiljøet og materialetypen. Til ortopædiske anvendelser er det ønskeligt at evaluere interaktionerne mellem de relevante knogleceller og implantater, når de er i direkte kontakt med hinanden. Den direkte dyrkningsmetode kunne bruges til at undersøge interaktionerne mellem de nyfrøede celler og implantatet. I kardiovaskulære applikationer, da de etablerede celler direkte eller indirekte kommer i kontakt med de implanterede stentmaterialer, kan direkte eksponeringskultur og eksponeringskulturmetoder anvendes til at evaluere cytokompatibiliteten af bionedbrydelige metaller til kardiovaskulære anvendelser. Vi mener, at de in vitro-metoder , der er beskrevet i denne artikel, er mulige at tilvejebringe indledende beviser for cytokompatibiliteten af bionedbrydelige implantatmaterialer. Dyrkningsmetoderne skal modificeres til forskellige materialer med forskellige nedbrydningsmekanismer, produkter og hastigheder. For eksempel kan dyrkningstiden for forskellige materialer ændres baseret på forskellige nedbrydningshastigheder for forskellige materialetyper. Forskellige resultater kan indsamles baseret på forskellige nedbrydningsmekanismer og produkter af materialerne.

Sammenfattende er det vigtigt at analysere cellerne, mediet og prøvematerialerne kvalitativt og kvantitativt før og efter in vitro-cellekultur for at forstå virkningerne af biologisk nedbrydelige implantatmaterialer og deres nedbrydningsprodukter på cytokompatibilitet. De tre kulturmetoder, der præsenteres i denne artikel, kan bruges til at studere en bred vifte af biologisk nedbrydelige materialer, herunder biologisk nedbrydelige polymerer, keramik og metaller til medicinske implantat- og vævstekniske applikationer. Disse in vitro-celleundersøgelser er værdifulde til screening af biologisk nedbrydelige materialer, optimering af design af implanterbare enheder og stilladser i den tidlige fase af produktudviklingen og reduktion af potentiel toksicitet for celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne sætter pris på den økonomiske støtte fra US National Science Foundation (NSF CBET-prisen 1512764 og NSF PIRE 1545852), National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship og Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) og UC-Riverside Dissertation Research Grant (Jiajia Lin). Forfatterne sætter pris på Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) ved UC-Riverside til brug af SEM / EDS og Dr. Perry Cheung til brug af XRD-instrumenter. Forfatterne sætter også pris på Thanh Vy Nguyen og Queenie Xu for delvis redigering. Forfatterne vil også gerne takke Cindy Lee for at optage fortællingen til videoen. Eventuelle meninger, resultater og konklusioner eller anbefalinger, der udtrykkes i denne artikel, er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis synspunkterne fra National Science Foundation eller National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL serological pipette VWR 490019-704
12-well tissue-culture-treated plates Thermo Fisher Scientific 353043
15 mL conical tube (Polypropylene) VWR 89039-666
18 G needle BD 305196
25½ G needle BD 305122
4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI) Invitrogen D3571
50 mL conical tube (Polypropylene) VWR 89039-658
70 μm nylon strainer Fisher Scientific 50-105-0135
Alexa Flour 488-phalloidin Life technologies A12379
Biological safety cabinet LABCONCO Class II, Type A2
Centrifuge Eppendorf Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430
Clear Fused Quartz Round Dish AdValue Technology FQ-4085
CO2 incubator SANYO MCO-19AIC
CoolCell Freezer Container Corning 432000 foam container designed to regulate temperature decrease
Cryovial Thermo Fisher Scientific 5000-1020
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 472301
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5648
EDX analysis software Oxford Instruments AztecSynergy
Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) FEI 50mm2 X-Max50 SDD
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific Inc. SH30910
Fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti
Formaldehyde VWR 100496-496
Hemacytometer Hausser Scientific 3520
ImageJ software National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin)
Inductively coupled plasma
optical emission spectrometry (ICP-OES)		 PerkinElmer Optima 8000
Optical microscope VWR VistaVision
Penicillin/streptomycin (P/S) Thermo Fisher Scientific, Inc., 15070063
pH meter VWR model SB70P
Phosphate Buffered Saline (PBS) VWR 97062-730
Scanning electronic microscope (SEM) FEI Nova NanoSEM 450
surgical blade VWR 76353-728
Tissue Culture Flasks VWR T-75, MSPP-90076
Transwell inserts Corning 3460
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA) Sigma-Aldrich T4049
X-ray diffraction instrument (XRD) PANalytical Empyrean Series 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, C., et al. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr Alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (1), 517-538 (2019).
  2. Xu, C., et al. A green biocompatible fabrication of highly porous functional ceramics with high strength and controllable pore structures. Journal of Materials Science & Technology. 32 (8), 729-732 (2016).
  3. Asgari, M., et al. Biodegradable metallic wires in dental and orthopedic applications: a review. Metals. 8 (4), 212 (2018).
  4. Shi, Y., Liu, J., Yu, L., Zhong, L. Z., Jiang, H. B. β-TCP scaffold coated with PCL as biodegradable materials for dental applications. Ceramics International. 44 (13), 15086-15091 (2018).
  5. Wu, C. -C., et al. A self-reinforcing biodegradable implant made of poly (ɛ-caprolactone)/calcium phosphate ceramic composite for craniomaxillofacial fracture fixation. Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery. 44 (9), 1333-1341 (2016).
  6. Jiang, W., et al. In vitro evaluation of MgSr and MgCaSr alloys via direct culture with bone marrow derived mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 72, 407-423 (2018).
  7. Zhang, C., et al. Magnesium-based biodegradable microelectrodes for neural recording. Materials Science and Engineering: C. 110, 110614 (2020).
  8. Jia, B., et al. In vitro and in vivo studies of Zn-Mn biodegradable metals designed for orthopedic applications. Acta Biomaterialia. 108, 358-372 (2020).
  9. Yang, H., et al. Alloying design of biodegradable zinc as promising bone implants for load-bearing applications. Nature Communications. 11 (1), 1-16 (2020).
  10. Liu, H., et al. Injectable, biomechanically robust, biodegradable and osseointegrative bone cement for percutaneous kyphoplasty and vertebroplasty. International Orthopaedics. 42 (1), 125-132 (2018).
  11. Anjum, S., Arora, A., Alam, M., Gupta, B. Development of antimicrobial and scar preventive chitosan hydrogel wound dressings. International Journal of Pharmaceutics. 508 (1-2), 92-101 (2016).
  12. Barroca, N., et al. Electrically polarized PLLA nanofibers as neural tissue engineering scaffolds with improved neuritogenesis. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167, 93-103 (2018).
  13. Liu, Y., et al. Polydopamine-modified poly (l-lactic acid) nanofiber scaffolds immobilized with an osteogenic growth peptide for bone tissue regeneration. RSC Advances. 9 (21), 11722-11736 (2019).
  14. Liu, H., Webster, T. J. Enhanced biological and mechanical properties of well-dispersed nanophase ceramics in polymer composites: from 2D to 3D printed structures. Materials Science and Engineering: C. 31 (2), 77-89 (2011).
  15. Xu, C., et al. Bioinspired mechano-sensitive macroporous ceramic sponge for logical drug and cell delivery. Advanced Science. 4 (6), 1600410 (2017).
  16. Xu, C., Bai, Y., Yang, H., Yang, L. Mechanically modulated, ultra-high precision logic delivery of molecules by bio-inspired macroporous ceramic sponge. MRS Advances. 2 (19-20), 1125-1130 (2017).
  17. Zhang, N., Xu, C., Azer, A., Liu, H. Dispersibility and characterization of polyvinyl alcohol-coated magnetic nanoparticles in poly (glycerol sebacate) for biomedical applications. Journal of Nanoparticle Research. 21 (12), 1-11 (2019).
  18. Kim, S. S., et al. A poly (lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite composite scaffold with enhanced osteoconductivity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 206-215 (2007).
  19. Cipriano, A. F., et al. Degradation of bioresorbable Mg-4Zn-1Sr intramedullary pins and associated biological responses in vitro and in vivo. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (51), 44332-44355 (2017).
  20. Surmeneva, M. A., et al. Bone marrow derived mesenchymal stem cell response to the RF magnetron sputter deposited hydroxyapatite coating on AZ91 magnesium alloy. Materials Chemistry and Physics. 221, 89-98 (2019).
  21. Sheikh, Z., et al. Mechanisms of in vivo degradation and resorption of calcium phosphate based biomaterials. Materials. 8 (11), 7913-7925 (2015).
  22. Klein, C., Driessen, A., De Groot, K., Van den Hooff, A. Biodegradation behavior of various calcium phosphate materials in bone tissue. Journal of Biomedical Materials Research. 17 (5), 769-784 (1983).
  23. Lanao, R. P. F., Leeuwenburgh, S. C., Wolke, J. G., Jansen, J. A. Bone response to fast-degrading, injectable calcium phosphate cements containing PLGA microparticles. Biomaterials. 32 (34), 8839-8847 (2011).
  24. Vey, E., et al. Degradation kinetics of poly (lactic-co-glycolic) acid block copolymer cast films in phosphate buffer solution as revealed by infrared and Raman spectroscopies. Polymer Degradation and Stability. 96 (10), 1882-1889 (2011).
  25. Standard, I. Biological evaluation of medical devices-Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. Geneve, Switzerland: International Organization for Standardization. , (2009).
  26. Liu, X., Zhou, W., Wu, Y., Cheng, Y., Zheng, Y. Effect of sterilization process on surface characteristics and biocompatibility of pure Mg and MgCa alloys. Materials Science and Engineering: C. 33 (7), 4144-4154 (2013).
  27. Liu, H., Yazici, H., Ergun, C., Webster, T. J., Bermek, H. An in vitro evaluation of the Ca/P ratio for the cytocompatibility of nano-to-micron particulate calcium phosphates for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 4 (5), 1472-1479 (2008).
  28. Liu, H., et al. Enhancing effects of radiopaque agent BaSO4 on mechanical and biocompatibility properties of injectable calcium phosphate composite cement. Materials Science and Engineering: C. 116, 110904 (2020).
  29. Xu, C., et al. A versatile three-dimensional foam fabrication strategy for soft and hard tissue engineering. Biomedical Materials. 13 (2), 025018 (2018).
  30. Speranza, V., Sorrentino, A., De Santis, F., Pantani, R. Characterization of the polycaprolactone melt crystallization: complementary optical microscopy, DSC, and AFM studies. The Scientific World Journal. , 720157 (2014).
  31. Cipriano, A. F., et al. Anodization of magnesium for biomedical applications-Processing, characterization, degradation and cytocompatibility. Acta Biomaterialia. 62, 397-417 (2017).
  32. Li, H., Chang, J. pH-compensation effect of bioactive inorganic fillers on the degradation of PLGA. Composites science and technology. 65 (14), 2226-2232 (2005).
  33. Xu, C., Hung, C., Cao, Y., Liu, H. H. Tunable crosslinking, reversible phase transition, and 3D printing of hyaluronic acid hydrogels via dynamic coordination of innate carboxyl groups and metallic ions. ACS Applied Bio Materials. 4 (3), 2408-2428 (2021).
  34. Cortez Alcaraz, M. C., et al. Electrophoretic deposition of magnesium oxide nanoparticles on magnesium: processing parameters, microstructures, degradation, and cytocompatibility. ACS Applied Bio Materials. 2 (12), 5634-5652 (2019).
  35. Rutherford, D., et al. Synthesis, characterization, and cytocompatibility of yttria stabilized zirconia nanopowders for creating a window to the brain. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 108 (3), 925-938 (2020).
  36. Tian, Q., Deo, M., Rivera-Castaneda, L., Liu, H. Cytocompatibility of magnesium alloys with human urothelial cells: a comparison of three culture methodologies. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (9), 1559-1571 (2016).
  37. Nguyen, T., Cipriano, A., Guan, R. G., Zhao, Z. Y., Liu, H. In vitro interactions of blood, platelet, and fibroblast with biodegradable magnesium-zinc-strontium alloys. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2974-2986 (2015).
  38. Jiang, W., Lin, J., Chen, A. H., Pan, J., Liu, H. A portable device for studying the effects of fluid flow on degradation properties of biomaterials inside cell incubators. Regenerative Biomaterials. 6 (1), 39-48 (2019).
  39. Tian, Q., et al. Responses of human urothelial cells to magnesium-zinc-strontium alloys and associated insoluble degradation products for urological stent applications. Materials Science and Engineering: C. 96, 248-262 (2019).
  40. Wetteland, C. L., Liu, H. Optical and biological properties of polymer-based nanocomposites with improved dispersion of ceramic nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (10), 2692-2707 (2018).
  41. Wetteland, C. L., Nguyen, N. -Y. T., Liu, H. Concentration-dependent behaviors of bone marrow derived mesenchymal stem cells and infectious bacteria toward magnesium oxide nanoparticles. Acta Biomaterialia. 35, 341-356 (2016).
  42. Aoi, W., Marunaka, Y. The importance of regulation of body fluid pH in the development and progression of metabolic diseases. Advances in Medicine and Biology. 77, 177-189 (2014).
  43. Wang, H. Hydroxyapatite degradation and biocompatibility. , The Ohio State University. (2004).

Tags

Bioengineering udgave 182 cytokompatibilitet mesenkymale stamceller (BMSC'er) bionedbrydelige biomaterialer direkte kultur kultur med direkte eksponering eksponeringskultur
Direkte og indirekte dyrkningsmetoder til undersøgelse af biologisk nedbrydelige implantatmaterialer <em>in vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, C., Chen, Y., Lin, J., Liu, H.… More

Xu, C., Chen, Y., Lin, J., Liu, H. H. Direct and Indirect Culture Methods for Studying Biodegradable Implant Materials In Vitro. J. Vis. Exp. (182), e63065, doi:10.3791/63065 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter