الفحص القائم على المجهر لدراسة وتحليل الإندوسومات المعاد تدويرها باستخدام الاتجار في SNARE
Summary
إعادة تدوير الاندوسومات هي جزء من شبكة أنبوبية endosomal. هنا نقدم طريقة لقياس ديناميات إعادة تدوير الاندوسومات باستخدام GFP-STX13 كعلامة عضوية.
Abstract
إعادة تدوير الاندوسومات (REs) هي العضيات الأنبوبية المركبات المتولدة من الإنسومات المبكرة / الفرز في جميع أنواع الخلايا. تلعب هذه العضيات دورا رئيسيا في التكوين الحيوي للميلانوسومات ، وهي عضوية مرتبطة بالليسوسوم تنتجها الخلايا الصباغية. REs تسليم البضائع الخاصة بالخلايا الصباغية إلى الميلانوسومات المبكرة أثناء تشكيلها. انسداد في جيل REs، لوحظ في العديد من المسوخ من متلازمة هيرمانسكي بودلاك، يؤدي إلى نقص التصبغ من الجلد والشعر والعين. لذلك ، فإن دراسة ديناميكيات (الرجوع إلى عدد وطول) REs مفيدة لفهم وظيفة هذه العضيات في الظروف الطبيعية والمرضية. في هذه الدراسة، ونحن نهدف إلى قياس ديناميات RE باستخدام STX13 SNARE المقيمين.
Introduction
يحدث التمثيل الحيوي لأصباغ الميلانين في الميلانوسومات ، وهي عضوية مرتبطة بالليسوسومات الخاصة بالخلايا الصباغية (LRO) تتعايش مع الليسوسومات التقليدية. يلعب النظام الإندوسيتيكي دورا رئيسيا في التكوين الحيوي للميلانوسومات ، المطلوبة للون البشرة وprotection ضد الإشعاع المؤين1،2،3. خلال هذه العملية، يتم فرز الإنزيمات توليف الميلانين على الاندوسومات في وقت مبكر / الفرز ومن ثم نقلها إلى الميلانوسومات المبكرة من خلال الاندوسومات أنبوبي أو المركبات تسمى إعادة تدوير الانسومات (REs)4،5،6،7،8،9،10. استهداف وانصهار هذه العضيات تنظيم نضوج الميلانوسومات المصطبغة تعمل بكامل طاقتها7،11،12،13،14. العيوب في تشكيل هذه العضيات أو فرز البضائع إلى هذه العضيات تسبب المهق oculocutaneous وغيرها من الأنماط الظاهرية السريرية، لوحظ في متلازمة هيرمانسكي بودلاك15،16.
هنا نصف تقنية بسيطة تعتمد على المجهر لدراسة وتحليل REs. في هذه الطريقة، لقد استفدنا من بروتين ترانسممبران، Qa-SNARE Syntaxin (STX)13 الذي يقيم على إعادة تدوير endosomes17 ودورات بين الاندوسومات الفرز والميلانوسومات في الخلايا الصباغية12،18. علاوة على ذلك ، فإن حذف النطاق التنظيمي غير المنظم N-terminal (أي SynN أو STX13Δ129) يسمح لل SNARE بالتعثر في الميلانوسومات ، والذي يقيس مسار الاتجار إلى الأمام نحو الميلانوسوم12. لقد استخدمنا علامة إعادة تدوير نهايةوسومية معروفة Rab GTPase (Rab)11 في دراساتنا14,19. التصوير الفلوري للبروتينات GFP-STX13WT، GFP-STX13Δ129، mCherry-Rab11، و TYRP1 في الخلايا الصباغية البرية من النوع تليها تحديد كمي لتوطينها النسبي سيوفر طبيعة وديناميات REs بالإضافة إلى استهدافها للميلانوسومات. وهكذا، هذه تقنية بسيطة يمكن استخدامها لتصور وقياس ديناميات REs في الخلايا الصباغية.
Protocol
Representative Results
Discussion
إعادة تدوير الاندوسومات هي مجموعة من العضيات الانسطية، وأنها تتوسط في إعادة تدوير البضائع إلى سطح الخلية في جميع أنواع الخلايا21،22،23،24،25. في أنواع الخلايا المتخصصة مثل الخلايا الصباغية، تحول هذه ال?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل قسم التكنولوجيا الحيوية (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 إلى SRGS)؛ مجلس بحوث العلوم والهندسة (CRG/2019/000281 إلى SRGS)؛ DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 إلى SRGS) وبرنامج شراكة IISc-DBT (إلى SRGS). تم دعم البنية التحتية في القسم من قبل DST-FIST و DBT و UGC. تم اعتماد AMB من قبل DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02).
Materials
| anti-TYRP1 antibody (TA99) | ATCC | HB-8704 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668-500 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 022600-050 | |
| Phorbol-12-myristate-13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher Scientific | 31800-022 |
Referencias
- Dell’Angelica, E. C. The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles. Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).
- Raposo, G., Marks, M. S. Melanosomes–dark organelles enlighten endosomal membrane transport. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (10), 786-797 (2007).
- Ohbayashi, N., Fukuda, M. Recent advances in understanding the molecular basis of melanogenesis in melanocytes. F1000Research. 9, (2020).
- Theos, A. C., et al. Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase sorting from endosomes to melanosomes. Molecular Biology of the Cell. 16 (11), 5356-5372 (2005).
- Di Pietro, S. M., et al. BLOC-1 interacts with BLOC-2 and the AP-3 complex to facilitate protein trafficking on endosomes. Molecular Biology of the Cell. 17 (9), 4027-4038 (2006).
- Setty, S. R., et al. BLOC-1 is required for cargo-specific sorting from vacuolar early endosomes toward lysosome-related organelles. Molecular Biology of the Cell. 18 (3), 768-780 (2007).
- Delevoye, C., et al. AP-1 and KIF13A coordinate endosomal sorting and positioning during melanosome biogenesis. Journal of Cell Biology. 187 (2), 247-264 (2009).
- Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Burek, C. L., Di Pietro, S. M. BLOC-2, AP-3, and AP-1 proteins function in concert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking to lysosome-related organelles. Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19550-19563 (2012).
- Sitaram, A., et al. Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).
- Nag, S., et al. Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles. Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).
- Dennis, M. K., et al. BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery. Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).
- Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis. Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).
- Shakya, S., et al. Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes. EMBO Reports. 19 (12), 45918 (2018).
- Bowman, S. L., et al. A BLOC-1-AP-3 super-complex sorts a cis-SNARE complex into endosome-derived tubular transport carriers. Journal of Cell Biology. 220 (7), 202005173 (2021).
- Wei, M. L. Hermansky-Pudlak syndrome: a disease of protein trafficking and organelle function. Pigment Cell Research. 19 (1), 19-42 (2006).
- Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases. Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).
- Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes. Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).
- Mahanty, S., et al. Rab9A is required for delivery of cargo from recycling endosomes to melanosomes. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (1), 43-59 (2016).
- Delevoye, C., et al. Recycling endosome tubule morphogenesis from sorting endosomes requires the kinesin motor KIF13A. Cell Reports. 6 (3), 445-454 (2014).
- Ha, L., et al. ARF functions as a melanoma tumor suppressor by inducing p53-independent senescence. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (26), 10968-10973 (2007).
- Soldati, T., Schliwa, M. Powering membrane traffic in endocytosis and recycling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (12), 897-908 (2006).
- Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
- Hsu, V. W., Prekeris, R. Transport at the recycling endosome. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 528-534 (2010).
- Taguchi, T. Emerging roles of recycling endosomes. Journal of Biochemistry. 153 (6), 505-510 (2013).
- Goldenring, J. R. Recycling endosomes. Current Opinion in Cell Biology. 35, 117-122 (2015).
- Delevoye, C., Marks, M. S., Raposo, G. Lysosome-related organelles as functional adaptations of the endolysosomal system. Current Opinion in Cell Biology. 59, 147-158 (2019).
- Hsu, V. W., Bai, M., Li, J. Getting active: protein sorting in endocytic recycling. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 13 (5), 323-328 (2012).
- Desfougeres, Y., D’Agostino, M., Mayer, A. A modular tethering complex for endosomal recycling. Nature Cell Biology. 17 (5), 540-541 (2015).
- Le, L., Sires-Campos, J., Raposo, G., Delevoye, C., Marks, M. S. Melanosome biogenesis in the pigmentation of mammalian skin. Integrated Computational Biology. 61 (4), 1517-1545 (2021).
