Isolamento delle cellule endoteliali dal lume delle arterie carotidi di topo per esperimenti multi-omici a singola cellula
Summary
Presentiamo un metodo per isolare cellule e nuclei endoteliali dal lume delle arterie carotidi di topo esposte a condizioni di flusso stabili o disturbate per eseguire esperimenti omici a singola cellula.
Abstract
L’aterosclerosi è una malattia infiammatoria delle regioni arteriose esposte a flussi sanguigni disturbati (d-flow). Il D-flow regola l’espressione dei geni nell’endotelio a livello trascrittomico ed epigenomico, con conseguente risposta proaterogena. Recentemente, sono stati eseguiti studi di sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNAseq) e test a singola cellula per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (scATACseq) per determinare i cambiamenti di accessibilità trascrittomica e cromatina a una risoluzione a singola cellula utilizzando il modello di legatura parziale della carotide (PCL) del topo. Poiché le cellule endoteliali (ECs) rappresentano una frazione minore delle popolazioni cellulari totali nella parete arteriosa, è stato utilizzato un metodo di digestione luminale per ottenere preparati monocellulari arricchiti con EC. Per questo studio, i topi sono stati sottoposti a chirurgia PCL per indurre il flusso d nell’arteria carotide sinistra (LCA) mentre utilizzavano l’arteria carotide destra (RCA) come controllo. Le arterie carotidi sono state sezionate due giorni o due settimane dopo l’intervento chirurgico PCL. Il lume di ciascuna carotide è stato sottoposto alla digestione della collagenasi e sono state ottenute singole cellule arricchite con endotelio o singoli nuclei. Questi preparati monocellulari e mononuclei sono stati successivamente codificati a barre utilizzando una configurazione microfluidica 10x Genomics. Le singole cellule e i singoli nuclei con codice a barre sono stati quindi utilizzati per la preparazione dell’RNA, la generazione della libreria e il sequenziamento su un sequenziatore di DNA ad alto rendimento. Dopo l’elaborazione bioinformatica, i set di dati scRNAseq e scATACseq hanno identificato vari tipi di cellule dalla digestione luminale, costituite principalmente da EC . Erano presenti anche cellule muscolari lisce, fibroblasti e cellule immunitarie. Questo metodo di arricchimento CE ha aiutato a comprendere l’effetto del flusso sanguigno sull’endotelio, che avrebbe potuto essere difficile con il metodo di digestione totale delle arterie. Il metodo di preparazione a singola cellula arricchito con EC può essere utilizzato per eseguire studi omici a singola cellula in topi EC-knockout e transgenici in cui l’effetto del flusso sanguigno su questi geni non è stato studiato. È importante sottolineare che questa tecnica può essere adattata per isolare singole cellule arricchite di EC da espianti di arterie umane per eseguire studi meccanicistici simili.
Introduction
Questo laboratorio ha precedentemente dimostrato che l’induzione del d-flow porta a uno sviluppo rapido e robusto dell’aterosclerosi nei topi iperlipidemici 1,2. Il nuovo modello murino di aterosclerosi indotta da d-flow è stato possibile utilizzando la chirurgia della legatura parziale della carotide (PCL) 3. La chirurgia PCL induce condizioni di flusso sanguigno basso e oscillatorio o d-flow nell’arteria carotide sinistra legata (LCA). Al contrario, l’arteria carotide destra controlaterale (RCA) continua ad affrontare un flusso laminare stabile (s-flow). In precedenza, per comprendere l’effetto del d-flow sulle cellule endoteliali, le arterie carotidi venivano sezionate dopo un intervento chirurgico di legatura parziale e lavate con un agente lisante a base di fenolo e guanidina isotiocianato (metodo di lavaggio del DNA / RNA luminale)2,4, che forniva RNA o DNA “pooled bulk” arricchiti con endotelio. Questi aggregati di RNA o DNA bulk sono stati quindi elaborati per studi trascrittomici o studi epigenomici sul metiloma del DNA, rispettivamente 4,5,6. Questi studi hanno contribuito a scoprire più geni sensibili al flusso e microRNA i cui ruoli nella biologia endoteliale e nell’aterosclerosi sono stati ampiamente studiati 4,6,7.
Tuttavia, nonostante l’arricchimento endoteliale, questi studi di massa RNA / DNA non hanno potuto distinguere il ruolo specifico di ciascun tipo di cellula nella parete arteriosa nell’aterosclerosi indotta da d-flow. Sono stati eseguiti studi di isolamento a singola cellula arricchita di endotelio (sc) e di sequenziamento di scRNA e scATAC per superare questa limitazione8. Per questo, i topi C57Bl6 sono stati sottoposti alla chirurgia PCL per indurre il d-flow nella LCA mentre utilizzavano l’RCA esposto al flusso s come controllo. Due giorni o due settimane dopo l’intervento chirurgico PCL, i topi sono stati sacrificati e le carotidi sono state sezionate e ripulite. Il lume di entrambe le LCA e RCA è stato infuso con collagenasi e sono stati raccolti i digesti di collagenasi luminale contenenti EC come frazione significativa e altre cellule arteriose. La sospensione a singola cellula (scRNAseq) o la sospensione a nucleo singolo (scATACseq) sono state preparate e codificate a barre con identificatori univoci per ogni cellula o nucleo utilizzando una configurazione genomica 10x. Gli RNA sono stati sottoposti alla preparazione della libreria di cDNA e sequenziati.
I set di dati scRNAseq e scATACseq sono stati elaborati utilizzando il software Cell Ranger Single-Cell e ulteriormente analizzati dai pacchetti Seurat e Signac R 9,10. Ad ogni cellula e nucleo è stato assegnato un tipo di cellula da queste analisi e raggruppato nel tipo di cellula in base ai geni marcatori e ai modelli di espressione genica unici. I risultati di scRNAseq e scATACseq hanno dimostrato che questi preparati unicellulari sono arricchiti con EC e contengono anche cellule muscolari lisce (SMC), fibroblasti e cellule immunitarie.
Ulteriori analisi hanno rivelato che la popolazione EC nella digestione luminale è altamente divergente e plastica (8 diversi cluster EC) e reattiva al flusso sanguigno. Ancora più importante, questi risultati hanno dimostrato che il d-flow riprogramma le EC da un fenotipo antinfiammatorio protetto dall’atero a fenotipi pro-aterogeni, tra cui la transizione pro-infiammatoria, endoteliale-mesenchimale, la transizione delle cellule staminali / progenitrici endoteliali e, più sorprendentemente, la transizione da cellule endoteliali a cellule immunitarie. Inoltre, i dati di scATACseq rivelano nuovi cambiamenti di accessibilità della cromatina dipendenti dal flusso e siti di legame del fattore di trascrizione in modo genomico, che costituiscono la base di diverse nuove ipotesi. La metodologia e il protocollo per la preparazione di singole cellule endoteliali per studi multi-omici a singola cellula dalle arterie carotidi di topo sono dettagliati di seguito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per isolare i preparati unicellulari dalle arterie carotidi del topo. L’influenza del d-flow sulle cellule endoteliali può essere accuratamente studiata se la chirurgia PCL viene eseguita correttamente. È fondamentale identificare correttamente i rami della carotide comune, come la carotide esterna, la carotide interna, l’arteria occipitale e l’arteria tiroidea superiore. La convalida dei modelli di flusso mediante ecografia convalida ulteriormente l’insorgen…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti da sovvenzioni del National Institutes of Health HL119798, HL095070 e HL139757 a HJ. HJ è anche supportato dalla Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. I servizi forniti dall’Emory Integrated Genomics Core (EIGC) sono stati sovvenzionati dalla Emory University School of Medicine e sono stati anche parzialmente supportati dalla Georgia Clinical and Translational Science Alliance del National Institutes of Health con il premio no. UL1TR002378. Il contenuto fornito sopra è di esclusiva responsabilità degli autori e non riflette le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.
Materials
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube – Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Silk Suture Sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution,sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | or equivalent |
| ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Bovine Serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorphine | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Collagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | https://www.r-project.org | |
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
Referencias
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