DetectSyn:シナプス密度の変化を検出するための迅速で偏りのない蛍光法
Summary
DetectSynは、治療または疾患状態にわたる相対シナプス(シナプス前およびシナプス後関与)数の変化を測定する、偏りのない迅速な蛍光アッセイです。この技術は、培養ニューロンおよび固定組織の両方において使用することができる近接ライゲーション技術を利用する。
Abstract
シナプスはニューロン間のコミュニケーションの部位です。神経回路の強さはシナプス密度に関係しており、シナプスの破壊は大うつ病性障害(MDD)やアルツハイマー病などの疾患状態の特徴です。シナプス数を調べるための伝統的な技術には、蛍光マーカー(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP))の遺伝子発現、ニューロンを満たす色素(例えば、カルボシアニン色素、DiI)、および脊椎マーカーの免疫蛍光検出(例えば、シナプス後密度95(PSD95))が含まれる。これらのプロキシ技術の主な注意点は、シナプス後の変化のみを識別することです。しかし、シナプスはシナプス前終末とシナプス後脊椎との間の接続である。シナプスの形成/除去を測定するためのゴールドスタンダードには、時間のかかる電子顕微鏡またはアレイ断層撮影技術が必要です。これらの技術には、専門的なトレーニングと高価な機器が必要です。さらに、限られた数のニューロンしか評価できず、脳領域全体に対する変化を表すために使用される。DetectSynは、疾患状態または薬物活性に起因するシナプス形成または消失の変化を識別する迅速な蛍光技術である。DetectSynは、迅速な近接ライゲーションアッセイを利用して、並置されたシナプス前部およびシナプス後部タンパク質と標準的な蛍光顕微鏡法を検出します。得られた穿刺の蛍光検出により、実験の迅速かつ公平な分析が可能になります。DetectSynは、限られた数の蛍光ニューロンよりも広い領域を分析できるため、電子顕微鏡よりも代表的な結果を提供します。さらに、DetectSynは 、インビトロ 培養ニューロンおよび固定組織スライスに対して機能します。最後に、この技術から収集されたデータを分析するための方法が提供される。全体として、DetectSynは、治療または疾患状態にわたるシナプス密度の相対的な変化を検出するための手順を提供し、従来の技術よりもアクセスしやすい。
Introduction
シナプスは、ニューロン間のコミュニケーションの基本単位である1。同じ領域内のニューロン間の多くのシナプスは、行動を媒介する回路を生じる2。シナプスは、神経伝達物質または神経ペプチドを放出する1つのニューロンからのシナプス前末端からなり、別のニューロンのシナプス後受容体に情報を中継する。シナプス前部シグナルの総和は、シナプス後ニューロンが活動電位を発火させ、メッセージを他のニューロンに伝播するかどうかを決定する。
シナプス病理学、シナプスの分解は、アルツハイマー病および大うつ病性障害のような神経体積の減少によって特徴付けられる疾患および障害において生じ、もはや最適に実行しない回路をもたらす3,4,5。シナプス密度の回復は、これらの障害に対する潜在的な治療法の有効性の根底にある可能性が高い。例えば、シナプスの増加が急速な抗うつ薬の行動効果の根底にあることが最近実証されました6。可能なシナプス病理学的治療を迅速にスクリーニングするために、研究者はシナプス数の変化を迅速に特定する技術を必要とする。
現在の方法論は、時間と費用がかかるか(電子顕微鏡、アレイ断層撮影)、またはシナプス前部の関与(脊椎分析、免疫蛍光/共局在化)を組み込まずにシナプス後の変化のみを調べる。DiIのような色素やGFPのような蛍光タンパク質は、ニューロンを視覚化し、シナプス後棘を特徴付けるのに役立ちます。しかし、脊椎解析では、研究者が定義した比率を使用して形態を決定し、再現性を低下させる可能性があります7。さらに、異なる脊椎クラスが機能的シナプスとどのように関連しているかは、まだ明らかにされていない8。脊椎形成は一過性であり得、シナプス後可塑性を反映する可能性があるが、これらの脊椎はシナプス前ニューロン9を有するシナプスに安定する前に排除され得る。
共局在化は、シナプス前およびシナプス後タンパク質を免疫染色することができるため、脊椎分析よりもシナプスのより良いプロキシを提供する。しかしながら、シナプスタンパク質は、タンパク質が並置され、一貫して重なり合わない可能性があるため、低い共局在値をもたらす可能性がある。したがって、タンパク質は完全に重ね合わされていないため、共局在化技術は、この欠落した情報のためにシナプス形成の変化を正確に測定できない可能性がある。最後に、電子顕微鏡(EM)とアレイ断層撮影法の両方がシナプスの高解像度画像を提供しますが、時間がかかります。EMはさらに特殊な装置を必要とし、研究者は任意の実験のために少量の組織に制限されている。アレイ断層撮影法は、超薄切片上の多くのタンパク質を優雅にスクリーニングする能力を提供し、EM10と組み合わせることができるが、この技術はあまりにも労働集約的であり、シナプス形成の変化を迅速にスキャンする必要がある実験の範囲を超えている可能性がある。
DetectSynは、デュオリンク近接ライゲーションアッセイの特定のアプリケーションです。PLAアッセイは、タンパク質間相互作用の一般的な検出を可能にします。DetectSynは、タグ付きのシナプス前およびシナプス後タンパク質によって放出される蛍光シグナルを互いに40nm以内に増幅することによって、シナプス後部のプロキシブリッジ測定を行います。シナプスタンパク質がシナプス間隙内と同様に40nm以内にある場合、DNAプローブを含む二次抗体は環状DNAにハイブリダイズする。このハイブリダイズした環状DNAは蛍光プローブを発現し、次いでこれを増幅し、標準的な蛍光顕微鏡技術で検出する( 図1参照)。重要なことに、EMやアレイ断層撮影法とは異なり、この技術は特別な装置を必要とせず、標準的な免疫組織化学とほぼ同じ時間がかかります。したがって、この技術のアクセシビリティにより、研究集約型機関以外の研究者はシナプト病理学研究に参加することができます。さらに、この技術は、単一の実験内で複数の脳領域におけるシナプス密度の変化を調べることができ、疾患または治療によるシナプス変化のより全体的な表現を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
DetectSynは、近接ライゲーションアッセイを使用して互いに40nm以内のタンパク質を検出する迅速なアッセイであり、シナプス形成の検出を可能にする。この技術は、シナプス形成の代理測定としてのみ役立つ現在の蛍光アッセイを改善する。DetectSynは、互いの40nm以内、すなわちシナプス間隙内に局在するシナプスタンパク質の定量可能な変化を検出する。さらに、DetectSynは、シナプスを測定?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国国立衛生研究所 NINDS R01 NS105005 (KRG) および NS105005-03S1 (KRG)、国防総省 USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG)、NIAAA R01AA016852、NIAAA T32AA007565 (CFH)、および FRAXA Research (CFH) および Alzheimer’s Association, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG) からの助成金によって支援されました。
Materials
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP39920 | PBS made in house works, as well. |
| 24 well plates | Fisher Scientific | FB012929 | For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary. |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 15-078-290 | |
| Chicken anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Other clear nail polish works, as well. |
| Cold block | Fisher Scientific | 13131012 | |
| Computer workstation | HP | ||
| Confocal or fluorescent microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Donkey anti-chicken FITC | Fisher Scientific | SA1-72000 | |
| Duolink donkey anti-Mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink donkey anti-Rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Far Red | Sigma | DUO92013 | Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase. |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B. |
| Fine-tipped paintbrush | Fisher Scientific | NC9691026 | Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12545MP | Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 1255015 | For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary. |
| Freezer, -20°C | VWR | 76449-108 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 125480 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Image processing software | e.g. NIS Elements, ImageJ | ||
| Incubator | Fisher Scientific | 15-015-2633 | |
| Large petri dish, 100mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP24701 | |
| Mouse anti-Synapsin1 antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 02-106-1013 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-025 | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | Working volumes range from 3 µL to 500 µL |
| Plastic pasteur pipette | Fisher Scientific | 02-708-006 | |
| Precision tweezers/foreceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Rabbit anti-PSD95 antibody | Abcam | ab18258 | Other antibody pairs may work, as well, with optimization. |
| Refrigerator | VWR | 76470-402 | |
| Small petri dish, 60 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
Referencias
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