Síntesis de masarimicina, un inhibidor de molécula pequeña del crecimiento bacteriano grampositivo

Summary

Se presenta un protocolo detallado para preparar la masarimicina de diamida bacteriostática, una sonda de molécula pequeña que inhibe el crecimiento de Bacillus subtilis y Streptococcus pneumoniae al dirigirse a la degradación de la pared celular. Su aplicación como sonda química está demostrada en ensayos de sinergia/antagonismo y estudios morfológicos con B. subtilis y S. pneumoniae.

Abstract

El peptidoglicano (PG) en la pared celular de las bacterias es una estructura macromolecular única que confiere forma y protección del entorno circundante. Un elemento central para comprender el crecimiento y la división celular es el conocimiento de cómo la degradación de PG influye en la biosíntesis y el ensamblaje de la pared celular. Recientemente, se ha reportado el etiquetado metabólico de PG a través de la introducción de azúcares o aminoácidos modificados. Si bien es posible el interrogatorio químico de pasos biosintéticos con inhibidores de moléculas pequeñas, las herramientas de biología química para estudiar la degradación de PG por autolisinas están subdesarrolladas. Las autolisinas bacterianas son una amplia clase de enzimas que están involucradas en la degradación estrechamente coordinada de PG. Aquí, se presenta un protocolo detallado para preparar una sonda de molécula pequeña, masarimicina, que es un inhibidor de la N-acetilglucosaminidasa LytG en Bacillus subtilis, y el metabolismo de la pared celular en Streptococcus pneumoniae. Se proporciona la preparación del inhibidor a través de la síntesis orgánica clásica y asistida por microondas. Se presenta su aplicabilidad como herramienta para estudiar la fisiología Gram-positiva en ensayos biológicos.

Introduction

Peptidoglicano (PG) es un polímero similar a una malla que delinea la forma y estructura celular en bacterias Gram-positivas y Gram-negativas ^1,2. Este heteropolímero es una matriz de aminoazúcares reticulados por péptidos cortos ^3,4,5,6 con una columna vertebral compuesta por residuos de ácido N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido N-acetilmurámico (MurNAc) alternados β-(1,4) (Figura 1)1. Unido a la fracción C-3 lactyl de MurNAc es....

Protocol

1. Métodos generales

NOTA: Todos los compuestos se compraron a proveedores estándar y se utilizaron sin purificación adicional.

1. Realizar cromatografía de capa fina (TLC) sobre una placa de aluminio precubierta con gel de sílice XG F254. Detectar manchas debajo de una lámpara UV, por inmersión en tinción de p-anisaldehído, o por exposición al vapor I₂ .
2. Registre todos los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) en un espectrómetro de 400 MHz.
   NOTA: ¹espectro de RMN H y ¹³de RMN C se hicieron referencia a picos de disolventes residuales. Las constantes d....

Results

La masarimicina es un inhibidor bacteriostático de molécula pequeña de B. subtilis y S. pneumoniae y se ha demostrado que inhibe la GlcNAcase LytG de acción exo-acción en B. subtilis^35,37 y se dirige a la pared celular en S. pneumoniae³⁷. La masarimicina se puede preparar de manera eficiente mediante la síntesis orgánica clásica o asistida por microondas con rendimientos en el rango del 55% al 70%. La sí.......

Discussion

La masarimicina es un único inhibidor bacteriostático micromolar del crecimiento de B. subtilis³⁵ y S. pneumoniae³⁷ . En B. subtilis, se ha demostrado que la masarimicina inhibe la GlcNAcase LytG³⁵, mientras que no se ha identificado la diana molecular precisa en la pared celular de S. pneumoniae ³⁷. La síntesis de masarimicina utilizando la síntesis orgánica clásica o el procedimiento de microondas .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ácido 2-yodobenzoico	SIGMA-ALDRICH	I7675-25G	Polvo corrosivo, irritante, de color amarillo claro a marrón anaranjado
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	109827-4L	inflamable, irritante, incoloro
Acetonitrilo	SIGMA-ALDRICH	34851-4L	inflamable, irritante, incoloro
Placas de sílice con respaldo de aluminio	Sorbtech	4434126	gel de sílice XG F254 sobre placas con respaldo de aluminio
cloroformo-d	SIGMA-ALDRICH	151823-50G	solvente para RMN
Espectrómetro de masas compacto	Advion-Interchim	Advion CMS	espectrómetro de masas compacto equipado con fuente APCI y sonda de análisis de sólidos atmosféricos
Corning Costar 96 placas de fondo plano de pozos-estéril	fisher chemical	07-200-90	para ensayos de sinergia/antagonismo
cubreobjetos	fisher chemical	12-547	para microscopía
Ciclohexanocarboxaldehído	CHEM-IMPEX INT'L INC.	24451	líquido inflamable, irritante, incoloro a rosado
Isocianuro de ciclohexilo	SIGMA-ALDRICH	133302-5G	irritante, líquido incoloro, olor extremadamente desagradable
Ciclohexilamina	SIGMA-ALDRICH	240648-100ML	corrosivo, inflamable, irritante, líquido incoloro a menos que esté contaminado
Acetato de etilo	SIGMA-ALDRICH	537446-4L	inflamable, irritante, incoloro
cartucho de sílice flash líquida (12g)	Advion-Interchim	PF-50SIHP-F0012	paquete de columnas de sílice flash (12g) para la purificación de masarimycina
formaldehído	SIGMA-ALDRICH	F8775-25ML	agente fijador para microscopía
HEPES	SIGMA-ALDRICH	H8651-25G	tampón para solución de fijación de microscopía
Hexano, mezcla de isómeros	SIGMA-ALDRICH	178918-4L	perjudicial para el medio ambiente, inflamable, irritante, peligroso para la salud, líquido incoloro
Espectrómetro de masas compacto de alto rendimiento		Sonda	de análisis de sólidos atmosféricos (ASAP), baja resolución
High Vac	eppendorf	Vacufuge plus	vacío asistido por la fuerza centrífuga y la temperatura
Ácido clorhídrico	SIGMA-ALDRICH	258148-2.5L	corrosivo, irritante, incoloro
ácido clorhídrico	líquido SIGMA-ALDRICH	320331-2.5L
aceite de inmersión	fisher chemical	12-365-19	para microscopía
Yodo, cristales resublimados	Alfa Aesar	41955	perjudicial para el medio ambiente, irritante, peligro para la salud, gris oscuro/púrpura cristales
Mestre Mnova	MestreLab Research		software para el procesamiento de espectros de RMN
Metanol	SIGMA-ALDRICH	439193-4L	inflamable, tóxico, peligro para la salud, líquido incoloro
azul de metileno	SIGMA-ALDRICH	M9140-25G	Tinción microscópica para la tinción de paredes celulares
Placas de agar Meuller-Hinton + 5% de sangre de oveja	Fisher Química	B21176X	medios de crecimiento para Streptococcus pneumoniae
Caldo Meuller-Hinton	fisher chemical	DF0757-17-6 medio de	Streptococcus pneumoniae
	fisher chemical	22-310397	para microscopía
estación de laboratorio de síntesis por microondas	MILESTONE	START SYNTH	dispositivo que requiere la ventilación de una campana de gases, equipado con carrusel de síntesis
RMN SIGMA-ALDRICH		Z562769-5EA	Tubos de RMN de 5 mm 600 MHz
Resonancia Magnética Nuclear (RMN)	Bruker	Ascend 400	imán superconductor grande (400MHz)
Optocina	Fisher Químico	AAB21627MC	clorhidrato de etilhidrocupreína placas de
Petrie	Celltreat	229695	para la preparación de placas de agar para el crecimiento bacteriano
Microscopio de campo claro/contraste de fase Primo Star con cámara ERc5s	Zeiss		para estudios de morfología
puriFlash	interchim	XS520plus	sistema de purificación por cromatografía flash
resazurin	SIGMA-ALDRICH	R7017-1G	para ensayos de sinergia/antagonismo
evaporador rotativo	Heidolph	Hei-VAP Value "The Collegiate"	evaporador de disolvente
bicarbonato de sodio	SIGMA-ALDRICH	S6014-500G	irritante, blanco polvo
Cloruro de sodio	fisher químico	S271-1	cristalino, incoloro
Cloruro de sodio	SIGMA-ALDRICH	S5886-500G	para el crecimiento de B.subtilis y la preparación de medios LB
Sulfato de sodio	SIGMA-ALDRICH	7985592-500G	anhidro, granular,
triptona	fisher químico	BP1421-500	para el crecimiento de B.subtilis y preparación de medios LB
Whitney DG250 Workstation	Microbiology International	DG250	estación de trabajo anaeróbica. Mezcla de gases anaeróbicos utilizada: 5% de hidrógeno, 10% de dióxido de carbono, extracto de levadura de nitrógeno de equilibrio
	fisher chemical	BP1422-500	para el crecimiento de B.subtilis y preparación de medios LB
Zen Lite (azul) software	Zeiss		para la adquisición de micrografías