Modelagem de sinalização Wnt não canônica parácrina in vitro

Summary

O presente estudo descreve um método altamente reprodutível e tratável para estudar eventos de sinalização Wnt não canônica parácrina in vitro. Este protocolo foi aplicado para avaliar o impacto da sinalização parácrina Wnt5a em células da crista neural murina e mioblastos.

Abstract

A sinalização Wnt não canônica regula a organização do filamento de actina intracelular e a migração polarizada de células progenitoras durante a embriogênese. Este processo requer interações parácrinas complexas e coordenadas entre as células de envio e recepção de sinal. Dado que essas interações podem ocorrer entre vários tipos de células de diferentes linhagens, a avaliação in vivo de defeitos específicos da célula pode ser um desafio. O presente estudo descreve um método altamente reprodutível para avaliar a sinalização de Wnt parácrina não canônica in vitro. Este protocolo foi projetado com a capacidade de (1) realizar avaliações funcionais e moleculares de sinalização Wnt não canônica entre quaisquer dois tipos de células de interesse; (2) dissecar o papel das moléculas de envio de sinal versus moléculas receptoras de sinal na via de sinalização Wnt não canônica; e (3) realizar experimentos de resgate fenotípico com abordagens moleculares ou farmacológicas padrão.

Este protocolo foi utilizado para avaliar a sinalização Wnt não canônica mediada por células da crista neural (NCC) em mioblastos. A presença de NCCs está associada a um aumento do número de filopódios citoplasmáticos positivos para faloidina e lamellipodos nos mioblastos e à melhora da migração mioblástica em um ensaio de cicatrização de feridas. O eixo Wnt5a-ROR2 foi identificado como uma via de sinalização Wnt não canônica crucial entre os progenitores de cardiomioblastos NCC e do segundo campo cardíaco (SHF). Em conclusão, este é um protocolo altamente tratável para estudar mecanismos de sinalização Wnt não canônicos parácrinos in vitro.

Introduction

A sinalização Wnt não canônica é uma via conservada evolutivamente que regula a organização do filamento celular e a migração direcional. Essa via tem sido implicada em múltiplos processos biológicos, incluindo morfogênese do tecido embrionário ^1,2,3, angiogênese linfática e vascular ^4,5,6,7 e crescimento e metástase do câncer 8,9,10 . No nível celular, a sinalização Wnt não canônica é realizada através de interações parácrinas coordenadas entre as células emissoras e receptoras de sinal. Essas interações ocorrem frequentemente entre células de diferentes linhagens ou tipos e envolvem uma rede molecular diversificada que inclui até 19 ligantes e múltiplos receptores, co-receptores e efetores de transdução de sinal a jusante¹¹. Complicando ainda mais esse processo de sinalização, estudos anteriores mostraram que as combinações ligante-receptor podem variar de maneira dependente do contexto e do tecido 12,13, e que os mesmos ligantes de origem que acionam a sinalização Wnt não canônica em células receptoras de sinal podem ser produzidos por múltiplos tipos de células emissoras de sinal ^14,15 . Dada a complexidade celular e molecular associada à sinalização Wnt não canônica, a capacidade de estudar mecanismos individuais e clinicamente relevantes in vivo tem sido limitada.

Tentativas têm sido feitas para estudar a sinalização Wnt não canônica usando técnicas de cultura de células in vitro. Por exemplo, ensaios de cicatrização de feridas realizados em monocamadas celulares têm sido utilizados para avaliar funcionalmente a migração direcional celular 4,16,17,18,19. Técnicas de imunocoloração têm sido utilizadas para realizar análises espaciais da expressão de proteínas de superfície para avaliar alterações não canônicas induzidas por Wnt na morfologia celular 7,10, arquitetura e polarização assimétrica^18,19,20. Embora essas abordagens tenham fornecido ferramentas importantes para caracterizar fenótipos relacionados à Wnt em células receptoras de sinal, a falta de componentes emissores de sinal nesses protocolos limita sua capacidade de modelar com precisão os mecanismos de sinalização parácrina observados in vivo. Como resultado, permanece uma necessidade crítica de desenvolver sistemas in vitro que permitam uma avaliação robusta e reprodutível das interações de sinalização parácrina entre células emissoras e receptoras de sinais da via Wnt não canônica, particularmente aquelas de diferentes tipos celulares.

Para tanto, o objetivo primário deste estudo foi estabelecer um protocolo para modelar interações de sinalização Wnt não canônicas parácrinas in vitro. Desenvolvemos um sistema de cocultura sem contato que recapitula os componentes de envio e recepção de sinal dessas interações e permite o uso de abordagens moleculares, genéticas ou farmacológicas padrão para estudar independentemente mecanismos específicos de ligantes-receptores na via Wnt não canônica. Os mecanismos de sinalização Wnt mediada por NCC foram examinados em mioblastos usando linhagens celulares murinas estabelecidas. Como prova de princípio, este modelo foi utilizado para corroborar achados de estudos in vivo prévios em camundongos que implicam o eixo Wnt5a-ROR2 como uma via de sinalização Wnt não canônica relevante entre os NCCs²¹ e os progenitores cardiomioblastos SHF 3,22,23.

Protocol

1. Expansão pré-experimental e passagem de células Cultura de células C2C12:Preparar 500 mL de meio de cultura C2C12 combinando o meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina. Descongele um frasco para injetáveis de células C2C12 em banho-maria de 37 °C. Enquanto as células C2C12 estão descongelando, adicione 5 mL de meio C2C12 a um tubo cônico de 15 mL. Transfira imediatamente as células descongelada…

Representative Results

Efeitos dos psicanalistas sobre a capacidade migratória de mioblastos murinosEste ensaio foi aplicado pela primeira vez para avaliar o impacto dos psicanalistas na capacidade migratória dos mioblastos. A Figura 1 descreve o modelo esquemático do ensaio. Para testar esse impacto, ensaios de arranhões foram realizados com mioblastos que foram cultivados isoladamente (sem inserções NCC) em comparação com aqueles cultivados na presença de inserções. Como controle …

Discussion

A via de sinalização não canônica Wnt/polaridade celular planar (PCP) é uma via de sinalização celular criticamente importante que tem sido implicada em múltiplos processos de desenvolvimento 24,25 e doença^24,26. Durante o desenvolvimento embrionário, a sinalização Wnt não canônica envolve uma rede expansiva de sinais moleculares de células emissoras de sinais que, em última anál…

Materials

2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M-7522
Antifade mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200-10	Stored at 4 °C
Bovine serum albumin	Santa Cruz Biotechnology	sc-2323	Stored at 4 °C
C2C12 murine myoblast cell line	ATCC	CRL-1772
Cell culture flasks, 75 cm2	ThermoFisher Scientific	156499
Chamber Slide System, 4-well	ThermoFisher Scientific	154526
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM)	Corning	10-017-CV	Stored at 4 °C
Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	14-959-53A
Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane	Corning	353095
Fetal bovine serum	Fisher Scientific	W3381E	Stored in 50 mL aliquots at -20 °C
Gelatin solution, 0.1%	ATCC	PCS-999-027	Stored at 4 °C
Graduated and sterile pipette tips, 10 µL	USA Scientific	1111-3810
Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL	Millipore Sigma	ESG1106
L-glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
Lipofectamine RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778-075
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x	Gibco	11140-050
Minimum essential medium (MEM)	Corning	10-022-CV
Mitomycin C	Roche	10107409001
Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm	Springside Scientific	HRTCG2455
O9-1 neural crest cell line	Millipore Sigma	SCC049
Opti-MEM I, 1x	Gibco	31985-070
Paraformaldehyde solution in PBS, 4%	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Stored at 4 °C
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin)	Fisher Scientific	W3470H	Stored in 10 mL aliquots at -20 °C
Phalloidin-iFluor 488	Abcam	ab176753	Stored at -20 °C, Keep out of light
Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4	Corning	21-040-CV	Stored at 4 °C
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)	R&D Systems	233-FB-025
Recombinant human/mouse Wnt5a protein	R&D Systems	645-WN-010
Sodium pyruvate, 100 mM	Gibco	11360-070
Square Petri dish with grid	Thomas Scientific	1219C98
STO murine fibroblast feeder cells	ATCC	CRL-1503
Triton X-100 solution	Sigma Aldrich	X100-100ML
Trypsin-EDTA, 0.25%	Fisher Scientific	W3513C	Stored at 4 °C
Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope	Carl Zeiss AG
Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope	Carl Zeiss AG
Zen lite 2012 microscopy software	Carl Zeiss AG		imaging software