Viene descritta una metodologia di imaging a dispersione Raman coerente per visualizzare e quantificare i composti farmaceutici all’interno della pelle. Questo documento descrive la preparazione del tessuto cutaneo (umano e murino) e l’applicazione della formulazione topica, l’acquisizione di immagini per quantificare i profili di concentrazione spaziotemporale e l’analisi farmacocinetica preliminare per valutare la somministrazione topica di farmaci.
La farmacocinetica cutanea (cPK) dopo l’applicazione di formulazioni topiche è stata un’area di ricerca di particolare interesse per gli scienziati regolatori e di sviluppo di farmaci per comprendere meccanicamente la biodisponibilità topica (BA). Le tecniche semi-invasive, come lo stripping del nastro, la microdialisi cutanea o la microperfusione cutanea a flusso aperto, quantificano tutte la cPK su macroscala. Mentre queste tecniche hanno fornito una vasta conoscenza di cPK, la comunità manca di una comprensione meccanicistica della penetrazione e della permeazione del principio attivo farmaceutico (API) a livello cellulare.
Un approccio non invasivo per affrontare la cPK su microscala è il Raman scattering imaging (CRI) coerente, che si rivolge selettivamente alle vibrazioni molecolari intrinseche senza la necessità di etichette estrinseche o modifiche chimiche. CRI ha due metodi principali – anti-Stokes Raman scattering (CARS) e scattering Raman stimolato (SRS) – che consentono la quantificazione sensibile e selettiva di API o ingredienti inattivi. CARS viene in genere utilizzato per ricavare informazioni strutturali sulla pelle o visualizzare il contrasto chimico. Al contrario, il segnale SRS, che è lineare con la concentrazione molecolare, viene utilizzato per quantificare le API o gli ingredienti inattivi all’interno delle stratificazioni cutanee.
Sebbene il tessuto di topo sia stato comunemente utilizzato per cPK con CRI, il BA topico e la bioequivalenza (BE) devono essere valutati nel tessuto umano prima dell’approvazione normativa. Questo documento presenta una metodologia per preparare e visualizzare la pelle ex vivo da utilizzare in studi CRI di farmacocinetica quantitativa nella valutazione di BA e BE topici. Questa metodologia consente una quantificazione API affidabile e riproducibile all’interno della pelle umana e del mouse nel tempo. Le concentrazioni all’interno dei compartimenti ricchi di lipidi e poveri di lipidi, così come la concentrazione totale di API nel tempo sono quantificate; questi sono utilizzati per stime di MICRO e macroscala BA e, potenzialmente, BE.
Le metodologie per valutare la cPK dopo l’applicazione di un farmaco topico si sono estese dagli studi classici di test di permeazione in vitro (IVPT) 1,2,3,4,5 e tape-stripping 6,7,8 a metodologie aggiuntive come la microperfusione a flusso aperto o la microdialisicutanea 9,10,11, 12,13,14. Esistono potenzialmente vari siti locali di azione terapeutica a seconda della malattia di interesse. Quindi, potrebbe esserci un numero corrispondente di metodologie per valutare la velocità e la misura in cui un’API arriva al sito di azione locale previsto. Mentre ciascuna delle metodologie di cui sopra ha i suoi vantaggi, il principale svantaggio è la mancanza di informazioni cPK su microscala (cioè l’incapacità di visualizzare dove va l’API e come permea).
Una metodologia non invasiva di interesse per stimare BA e BE topici è CRI, che può essere suddivisa in due modalità di imaging: CARS e microscopia SRS. Questi metodi Raman coerenti consentono l’imaging chimicamente specifico delle molecole tramite effetti Raman non lineari. In CRI, due treni di impulsi laser vengono focalizzati e scansionati all’interno di un campione; la differenza di energia tra le frequenze laser è impostata per indirizzare modalità vibrazionali specifiche per le strutture chimiche di interesse. Poiché i processi CRI non sono lineari, un segnale viene generato solo al fuoco del microscopio, consentendo l’imaging tomografico farmacocinetico tridimensionale del tessuto. Nel contesto della cPK, CARS è stato utilizzato per ottenere informazioni strutturali sui tessuti, come la posizione delle strutture cutanee ricche di lipidi15. Al contrario, SRS è stato utilizzato per quantificare la concentrazione molecolare in quanto il suo segnale è lineare con la concentrazione. Per i campioni di pelle ex vivo , è vantaggioso eseguire CARS nella direzione epi16 e SRS in modalità di trasmissione17. Pertanto, i campioni di tessuto sottili consentiranno il rilevamento e la quantificazione del segnale SRS.
Come tessuto modello, l’orecchio del topo nudo presenta diversi vantaggi con piccoli inconvenienti. Un vantaggio è che il tessuto ha già uno spessore di ~ 200-300 μm e non richiede un’ulteriore preparazione del campione. Inoltre, diverse stratificazioni cutanee sono osservate concentrandosi assialmente attraverso un campo visivo (ad esempio, strato corneo, ghiandole sebacee (SG), adipociti e grasso sottocutaneo)16,18. Ciò consente una stima preclinica preliminare delle vie di permeazione cutanea e stime topiche di BA prima di passare a campioni di pelle umana. Tuttavia, il modello di topo nudo presenta limitazioni come la difficoltà di estrapolazione a scenari in vivo a causa delle differenze nella struttura della pelle19. Mentre l’orecchio del topo nudo è un modello eccellente per ottenere risultati preliminari, il modello della pelle umana è il gold standard. Sebbene ci siano stati vari commenti sull’idoneità e l’applicabilità della pelle umana congelata per ricapitolare accuratamente la cinetica di permeazione in vivo 20,21,22, l’uso della pelle umana congelata è un metodo accettato per la valutazione della cinetica di permeazione API in vitro 23,24,25 . Questo protocollo visualizza vari strati di pelle nella pelle di topo e umana mentre quantifica le concentrazioni di API all’interno di strutture ricche di lipidi e povere di lipidi.
Mentre cri è stato utilizzato in numerosi campi per visualizzare specificamente i composti all’interno dei tessuti, ci sono stati sforzi limitati per studiare la cPK dei prodotti farmaceutici applicati localmente. Per valutare il BA/BE topico dei prodotti topici utilizzando CRI, è necessario prima disporre di un protocollo standardizzato per effettuare confronti accurati. Gli sforzi precedenti che utilizzano CRI per la somministrazione di farmaci alla pelle hanno dimostrato variabilità all’interno dei dati. Poiché si tratta di un’applicazione relativamente nuova del CRI, stabilire un protocollo è fondamentale per ottenere risultati affidabili 18,26,27. Questo approccio si rivolge solo a un numero d’onda specifico nella regione biologica silenziosa dello spettro Raman. Tuttavia, la maggior parte delle API e degli ingredienti inattivi hanno spostamenti Raman all’interno della regione delle impronte digitali. Ciò ha precedentemente posto sfide a causa del segnale intrinseco derivante dal tessuto nella regione delle impronte digitali. I recenti progressi laser e computazionali hanno rimosso questa barriera, che può anche essere utilizzata in combinazione con l’approccio presentato qui28. Questo approccio qui presentato consente la quantificazione di un’API, che ha uno spostamento Raman nella regione silenziosa (2.000-2.300 cm-1). Questo non è limitato alle proprietà fisiochimiche del farmaco, che potrebbe essere il caso di alcune metodologie di monitoraggio cPK precedentemente menzionate29.
Il protocollo deve ridurre la variabilità da campione a campione nello spessore della pelle per vari preparati, poiché i campioni di pelle umana spessa produrranno un segnale minimo dopo l’applicazione del prodotto farmaceutico a causa della diffusione della luce da parte del campione spesso. Uno degli obiettivi di questo manoscritto è quello di presentare una metodologia di preparazione dei tessuti che assicuri standard di imaging riproducibili. Inoltre, il sistema CRI è configurato come descritto per ridurre le potenziali fonti di errore e minimizzare il rapporto segnale-rumore. Tuttavia, questo documento non discuterà i principi guida e i meriti tecnici del microscopio CRI in quanto questo è stato precedentemente trattato30. Infine, viene esplorata l’ampia procedura di analisi dei dati per consentire l’interpretazione dei risultati per determinare il successo o il fallimento di un esperimento.
La valutazione del BA/BE topico è un’area di ricerca che richiede un approccio sfaccettato in quanto nessun singolo metodo può caratterizzare completamente la cPK in vivo . Questo protocollo presenta una metodologia per la valutazione del BA/BE di un prodotto farmaceutico topico basato sull’imaging Raman coerente. Uno dei primi punti che potrebbero essere trascurati è quanto devono essere sottili i campioni di pelle, specialmente per l’imaging SRS a trasmissione quantitativa. Se la pelle è troppo spessa (<em…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Fotis Iliopoulos e Daniel Greenfield del Gruppo Evans per la loro discussione e correzione di bozze di questo manoscritto. Inoltre, gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno di LEO Pharma. La Figura 2 è stata creata con BioRender.com.
Tissue Preparation | |||
Autoclavable Biohazard Bags | FisherBrand | 22-044562 | As refered to in text: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | MT21030CV | As refered to in text: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv |
Disposable Scalpels | Exel International | 14-840-00 | As refered to in text: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-132 | As refered to in text: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | As refered to in text: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Bemis | 13-374-12 | As refered to in text: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
Petri Dish (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | As refered to in text: small petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB0875713A | As refered to in text: large petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
Surgical Scissors | Roboz | NC9411473 | As refered to in text: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC |
Laser/microscope | |||
650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | As refered to in text: CARS filter – CH2 vibrations (645nm/60nm filter) | |
Control box IX2-UCB | Olympus | As refered to in text: Control Box | |
D700/30m | Chroma | As refered to in text: CARS filter – deuterated band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m |
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DeepSee Insight | Spectra-Physics | As refered to in text: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser |
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Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | ThorLabs | PM100D | As refered to in text: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
Fluoview Software | Olympus | As refered to in text: Microscope Control software | |
Frosted Microscope Slides | FisherBrand | As refered to in text: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 |
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FV1000 | Olympus | As refered to in text: Microscope | |
Incubation Chamber | Tokai Hit | GM-800 | As refered to in text: incubation chamber |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S142C | As refered to in text: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
Power supply FV31-PSU | Olympus | As refered to in text: Power Supply | |
Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator | BK Precision | As refered to in text: function generator | |
ProScan – Precision Microscope Automation | Prior Scientific Instruments | As refered to in text: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation |
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SecureSeal Imaging Spacers | Grace Biolabs | 654004 | As refered to in text: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
SRS Detection Kit | APE | As refered to in text: SRS detector | |
UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | As refered to in text: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ |
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Lipid/Drug Imaging | |||
35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter | MatTek Corporation | NC9711297 | As refered to in text: Glass bottom dish https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
Cotton-tipped applicators | FisherBrand | As refered to in text: Cotton-tipped applicator | |
Distriman Postive Displacement Pipette | Gilson | As refered to in text: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= |
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Distriman Postive Displacement Pipette Tips | Gilson | As refered to in text: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true |
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Data Analysis | |||
FIJI | Open-source | As refered to in text: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ |
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Jupyter-Lab | open-source | As refered to in text: JupyterLab https://jupyter.org/ |
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Rstudio | Open-source | As refered to in text: Rstudio https://www.rstudio.com/ |