Aislamiento y perfil de células endoteliales arteriales mesentéricas primarias humanas a nivel de transcriptoma
Summary
El protocolo describe el aislamiento, el cultivo y el perfil de las células endoteliales de la arteria mesentérica humana. Además, se proporciona un método para preparar la arteria humana para la transcriptómica espacial. La proteómica, la transcriptómica y los ensayos funcionales se pueden realizar en células aisladas. Este protocolo se puede reutilizar para cualquier arteria de tamaño mediano o grande.
Abstract
Las células endoteliales (CE) son cruciales para la función vascular y de todo el cuerpo a través de su respuesta dinámica a las señales ambientales. Dilucidar el transcriptoma y el epigenoma de las CE es primordial para comprender sus funciones en el desarrollo, la salud y la enfermedad, pero está limitado en la disponibilidad de células primarias aisladas. Las tecnologías recientes han permitido el perfil de alto rendimiento del transcriptoma y el epigenoma de la CE, lo que ha llevado a la identificación de subpoblaciones de células de la CE previamente desconocidas y trayectorias de desarrollo. Si bien los cultivos de EC son una herramienta útil en la exploración de la función y la disfunción de la EC, las condiciones de cultivo y los múltiples pasajes pueden introducir variables externas que alteran las propiedades de la EC nativa, incluida la morfología, el estado epigenético y el programa de expresión génica. Para superar esta limitación, el presente artículo demuestra un método para aislar las CE primarias humanas de las arterias mesentéricas de donantes con el objetivo de capturar su estado nativo. Las CE en la capa íntima se disocian mecánica y bioquímicamente con el uso de enzimas particulares. Las células resultantes se pueden usar directamente para la secuenciación de ARN a granel o ARN unicelular o enchapadas para cultivo. Además, se describe un flujo de trabajo para la preparación de tejido arterial humano para transcriptómica espacial, específicamente para una plataforma disponible comercialmente, aunque este método también es adecuado para otras técnicas de perfilado de transcriptoma espacial. Esta metodología se puede aplicar a diferentes vasos recolectados de una variedad de donantes en estados de salud o enfermedad para obtener información sobre la regulación transcripcional y epigenética de la CE, un aspecto fundamental de la biología celular endotelial.
Introduction
Al revestir la luz de los vasos sanguíneos, las células endoteliales (CE) son reguladores cruciales del tono vascular y la perfusión tisular. Las CE son notables en su capacidad para reaccionar al entorno extracelular y adaptarse a los cambios en la dinámica y composición del flujo sanguíneo. Estas respuestas dinámicas están mediadas a través de una red de eventos de señalización intracelular, incluyendo modulaciones transcripcionales y post-transcripcionales con resolución espacio-temporal. La desregulación de estas respuestas está implicada en muchas patologías, incluyendo pero no limitado a enfermedades cardiovasculares, diabetes y cáncer 1,2.
Una gran proporción de los estudios utilizan líneas celulares o modelos animales para interrogar el transcriptoma de la CE. La primera es una herramienta útil, dada la relativa facilidad de uso y el bajo costo. Sin embargo, el cultivo en serie puede introducir alteraciones fenotípicas en las CE, como características fibroblásticas y una falta de polarización, desconectándolas de su estado in vivo 3. Las células primarias, por ejemplo, la EC de la vena umbilical humana (HUVEC) han sido una opción popular desde la década de 1980, pero se derivan de un lecho vascular del desarrollo que no existe en adultos, por lo que es poco probable que representen completamente las CE maduras. Los animales, especialmente los modelos de ratón, representan mejor el entorno fisiológico o fisiopatológico de las CE y permiten el interrogatorio de los transcriptomas como resultado de la perturbación genética. Las CE murinas se pueden aislar de varios tejidos, incluyendo la aorta, los pulmones y los tejidos adiposos utilizando procedimientos basados en enzimas 4,5,6,7. Sin embargo, las células aisladas no se pueden usar para múltiples pasajes a menos que se transformen6 y a menudo están limitadas en número, lo que requiere la agrupación de múltiples animales 5,8,9.
El advenimiento de nuevas tecnologías que exploran la arquitectura de los vasos a nivel transcriptómico, particularmente con resolución de una sola célula, ha permitido una nueva era de biología endotelial al revelar nuevas funciones y propiedades de las CE 5,10,11,12,13,14. Un rico recurso construido por los investigadores de Tabula Muris recopiló perfiles transcriptómicos unicelulares de 100,000 células, incluidas las CE en 20 órganos murinos diferentes15, que revelaron genes marcadores de CE comunes y firmas transcriptómicas únicas con diferencias inter e intrasulares 5,13. Sin embargo, existen claras diferencias entre el ratón y el ser humano en el genoma, el epigenoma y el transcriptoma, especialmente en las regiones no codificantes 16,17,18. Estos inconvenientes antes mencionados enfatizan la importancia del análisis de las CE utilizando muestras humanas para obtener un perfil fiel de las CE en su estado nativo en salud y enfermedad.
La mayoría de los métodos de aislamiento de EC se basan en la disociación física a través de la homogeneización, el corte fino y el picado del tejido antes de la incubación con enzimas proteolíticas durante diferentes tiempos. Las enzimas y condiciones también varían considerablemente entre los tipos de tejido, desde tripsina hasta colagenasa, utilizada sola o en combinación 19,20,21. A menudo se incluye un enriquecimiento o purificación adicional basado en anticuerpos para aumentar la pureza de las CE. Por lo general, los anticuerpos contra los marcadores de membrana EC, por ejemplo, CD144 y CD31 se conjugan con perlas magnéticas y se agregan a la suspensión celular22,23. Dicha estrategia puede adaptarse generalmente para el aislamiento CE de múltiples tejidos humanos y de ratón, incluidas las técnicas introducidas en este protocolo.
En su estado nativo, las CE interactúan con múltiples tipos de células y pueden existir en nichos vasculares donde la proximidad celular es crucial para la función. Si bien los estudios de secuenciación de ARN unicelular y nuclear único (scRNA y snRNA-seq) han sido primordiales para los avances recientes en la descripción de la heterogeneidad de la CE, el proceso de disociación interrumpe el contexto tisular y el contacto célula-célula, que también son importantes para comprender la biología de la CE. Desarrollado en 2012 y nombrado Método del Año en 202024, el perfil del transcriptoma espacial se ha utilizado para perfilar la expresión génica global al tiempo que conserva las características espaciales en varios tejidos, incluidos el cerebro25, el tumor26 y el tejido adiposo27. Las tecnologías pueden ser dirigidas, utilizando sondas especializadas específicas para secuencias particulares de ARN unidas a reactivos de afinidad o etiquetas fluorescentes, detectando así genes seleccionados a resolución subcelular 28,29,30,31. También pueden ser no dirigidos32,33, típicamente usando oligonucleótidos con código de barras espaciales para capturar ARN, que juntos se convierten en ADNc para la posterior preparación de la biblioteca seq y, por lo tanto, tiene la ventaja de deducir la expresión génica de tejido completo de manera imparcial. Sin embargo, la resolución espacial no se logra actualmente a un solo nivel celular con tecnologías disponibles comercialmente. Esto se puede superar hasta cierto punto con la integración de datos con datos scRNA-seq, lo que en última instancia permite el mapeo del transcriptoma unicelular en un contexto tisular complejo al tiempo que conserva su información espacial original34.
Aquí, se describe un flujo de trabajo para perfilar el transcriptoma de EC utilizando la arteria mesentérica superior humana, una arteria periférica que se ha utilizado para estudiar la vasodilatación, la remodelación vascular, el estrés oxidativo y la inflamación 35,36,37. Se describen dos técnicas: 1) aislar y enriquecer las CE a partir de la íntima de los vasos sanguíneos combinando la disociación mecánica y la digestión enzimática adecuadas para la secuenciación del transcriptoma unicelular o el posterior cultivo in vitro; 2) preparar secciones arteriales para el perfil del transcriptoma espacial (Figura 1). Estas dos técnicas se pueden realizar de forma independiente o complementaria para perfilar las CE y sus células circundantes. Además, este flujo de trabajo se puede adaptar para su uso en cualquier arteria mediana o grande.
Protocol
Representative Results
Discussion
El flujo de trabajo presentado detalla un conjunto de técnicas para perfilar las CE a partir de una sola pieza de arteria humana con resolución espacial y de una sola célula. Hay varios pasos críticos y factores limitantes en el protocolo. Una clave para el perfil del transcriptoma es la frescura del tejido y la integridad del ARN. Es importante mantener los tejidos en hielo tanto como sea posible antes del procesamiento para minimizar la degradación del ARN. Por lo general, los tejidos post mortem se procesan entre…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (a Z.B.C.); DP1DK126138 y DP1HD087990 (a S.Z.); una subvención de la Fundación Ella Fitzgerald y un Proyecto de la Familia Wanek (a Z.B.C.); y una subvención de la red de semillas del Atlas de Células Humanas (a Z.B.C. y S.Z.). La investigación reportada en esta publicación incluyó el trabajo realizado en el Núcleo de Genómica Integrativa en City of Hope con el apoyo del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio P30CA033572. Los autores desean agradecer al Dr. Ismail Al-Abdullah y al Dr. Meirigeng Qi del equipo de trasplante de islotes en City of Hope por el aislamiento de tejidos humanos, al Dr. Dongqiang Yuan en City of Hope por su ayuda con el análisis scRNA-seq, y al Dr. Marc Halushka en la División de Patología Cardiovascular de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins por sus invaluables conocimientos sobre histología vascular.
Materials
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 10 cm dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 23G needles | BD | 305145 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | AC327270010 | |
| 40 µm strainer | Fisher | 14100150 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent Technologies | G2991BA | |
| 5 mL tube | Thermo Fisher | 14282300 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| Attachment factor | Cell Applications | 123-500 | Attachment reagent in the protocol |
| Black wax | Any commercial black wax can be used | ||
| Bovine serum albumin heat shock treated | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Chloroform | Fisher | C607 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Cryostat brushes | |||
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | MT25950CQC | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Bacteria-derived protease in the protocol |
| Disposable Safety Scalpels | Myco Instrumentation | 6008TR-10 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | 14080055 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | 10437028 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| High sensitivity D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5603 | |
| High sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Incubator | Kept at 37 °C 5% CO2 | ||
| Isopropanol | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| Metal cannister | |||
| Microscope | Leica | To assess cell morphology | |
| Microvascular endothelial culture medium | Cell Applications | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker | Eppendorf | ||
| Optimal Cutting Temperature compound | Fisher | 4585 | |
| Plastic cryomolds | Fisher | 22363553 | |
| RNA screen tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| RNA screen Tape sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5577 | |
| RNase ZAP | Thermo Fisher | AM9780 | |
| RNase-free water | Takara | RR036B | RNase-free water (2) in kit |
| Sterile 12" long forceps | F.S.T | 91100-16 | |
| Sterile fine forceps | F.S.T | 11050-10 | |
| Sterile fine scissors | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold Slides | Fisher | 1518848 | |
| TRIzol reagent | Fisher | 15596018 | |
| Trypan Blue | Corning | MT25900CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red | Thermo Fisher | 12605010 | Cell-dissociation enzyme in the protocol |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway Package, 2rxns | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000184 |
Referencias
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