Die Kultivierung, das Wachstum und die Lebensfähigkeit von Milchsäurebakterien: Eine Qualitätskontrollperspektive
Summary
Die Qualitätskontrolle von Milchsäurebakterienkulturen (LAB) wurde als wirksamer Weg zur Verbesserung der Lebensfähigkeit und Funktionalität von LAB-Stämmen für Fermentationsverfahren bestätigt. Um diese Behauptung zu untermauern, haben wir ein Protokoll entwickelt, das aufklärt, wie LAB-Kulturen für Fermentations- und Bioprozessprozesse aktiviert und kultiviert werden.
Abstract
Milchsäurebakterien (LAB) sind essentielle Milchstarterkulturen, die maßgeblich für die Herstellung fermentierter Milchprodukte wie Joghurt und Käse eingesetzt werden. LAB produziert überwiegend Milchsäure als Hauptendprodukt der Fermentation und synthetisiert wichtige Metaboliten, die fermentierten Lebensmitteln die organoleptischen Eigenschaften verleihen. LAB sind anspruchsvolle Bakterien, die in vielen Umgebungen gedeihen, wenn ausreichende Ernährungsanforderungen erfüllt sind. Die Nachfrage nach überlegenen LAB-Molkerei-Starterkulturen für Fermentationsanwendungen in der Lebensmittel- und Milchindustrie hat dazu geführt, dass lebensfähige und aktive Kulturen für alle Bioprozessbetriebe bereitgestellt werden müssen. Die Entwicklung eines Standardprotokolls zur Sicherstellung der Lebensfähigkeit und verbesserten Funktionalität von LAB-Kulturen sowohl im Labor als auch in der Milchverarbeitung ist daher sehr wichtig. Bei der Behandlung von Bedenken im Zusammenhang mit der Wiederbelebung schwacher, gestresster und verletzter LAB-Kulturzellen ist ein Protokoll, das die wichtigsten Schritte zur Genesung, zur Verbesserung der Zellregeneration und zur Verbesserung der metabolischen Funktionalität von LAB-Stämmen anschaulich umreißt, von größter Bedeutung. Die Aufrechterhaltung der Reinheit, Funktionalität und Lebensfähigkeit der Kultur für LAB-Starterkulturen ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Daher wird die Einhaltung einer einzigartigen Protokollrichtlinie zur Förderung der Fermentationsleistung für viele LAB-Stämme führen, die für Fermentations- und Biotechnologieprozesse bestimmt sind. Infolgedessen hat das Labor für Lebensmittelmikrobiologie und Biotechnologie an der North Carolina Agriculture and Technical State University ein Standardprotokoll für die Aktivierung und Qualitätskontrolle ausgewählter LAB-Stämme entwickelt, das zu hochfunktionellen und lebensfähigen LAB-Kulturstämmen geführt hat, die für die Fermentationsforschung eingesetzt werden. Die Anpassung und Empfehlung eines solchen Protokolls für den Einsatz in der Milch- und Lebensmittelindustrie wird dazu beitragen, die Lebensfähigkeit und Funktionalität von LAB für viele Anwendungen sicherzustellen.
Introduction
Milchsäurebakterien (LAB) sind eine Gruppe von einzigartig vielfältigen Bakterien mit industriellem Potenzial. Stämme von Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus und Streptococcus thermophilus werden meist als Milchstarterkulturen für fermentierte Milchprodukte wie Joghurt1 verwendet. Ausgewählte LAB-Stämme werden ebenfalls als Probiotika eingestuft, da sie dem Menschen gesundheitliche Vorteile bieten, wenn die Dosierungen angemessen verabreicht werden2. Milchsäurebakterien sind ebenfalls grampositive, nicht sporenbildende, nicht atmende, aber aerotolerante Mikroorganismen, die sich im Allgemeinen durch die Produktion von Milchsäure als Schlüsselfermentationsprodukt auszeichnen. LAB synthetisiert auch essentielle Metaboliten, z. B. organische Säuren, Bakteriocine und andere antimikrobielle Verbindungen3, die ein breites Spektrum lebensmittelbedingter Krankheitserreger hemmen können4. Milchsäure, ein Hauptendprodukt des Kohlenhydratkatabolismus und ein Nebenprodukt der LAB-Fermentation, ist ein organischer Metabolit, der antimikrobielle Eigenschaften besitzt und potenziell für Anwendungen zur Biokonservierung von Lebensmitteln nützlich ist 3,5,6. Darüber hinaus verleihen die von LAB hergestellten organischen Säuren den Geschmack, die Textur und das Aroma von Lebensmitteln und verbessern so ihre organoleptischen Eigenschaften insgesamt 5,6. Die unterschiedlichen Ernährungsanforderungen von LAB in Verbindung mit ihrer allgegenwärtigen Natur ermöglichen es den Bakterien schließlich, in verschiedenen Umgebungen wie Milchprodukten, fermentierten Lebensmitteln, Gemüse sowie im menschlichen Darm leicht zu gedeihen7.
Es gibt eine wachsende Nachfrage nach Starterkulturen von LAB für die Joghurtherstellung und viele verschiedene Milchanwendungen8,9, daher sollten kritische Aufmerksamkeit und etablierte wissenschaftliche Techniken eingehalten werden, sowohl bei der Kultivierung von LAB-Stämmen als auch bei der Aktivierung von lyophilisierten und isolierten Stämmen, da diese Aktivität für eine verbesserte Fermentationsleistung von entscheidender Bedeutung ist. Das Labor für Lebensmittelmikrobiologie und Biotechnologie engagiert sich daher aktiv in der Entwicklung geeigneter Technologien, die auf die Aktivierung, das überlegene Wachstum und die Fermentationseigenschaften von LAB-Stämmen ausgerichtet sind, die aus fermentierten Milchprodukten sowie aus industriellen Starterkulturen für die Joghurtherstellung isoliert werden. Darüber hinaus ist es bemerkenswert, dass industriell hergestellte LAB-Kulturstämme konservierenden Aktivitäten wie Gefriertrocknung und Tiefkühllagerung unterzogen werden, was zu Zellstress und Verletzungen führt, als Folge des Kälteschockprozesses, dem sie ausgesetzt sind10. Bei der Begrenzung der Lebensfähigkeitsherausforderungen und der Verbesserung der Funktionalität von LAB-Stämmen, die entweder aus isolierten Lebensmittelprodukten oder gefriergetrockneten Produkten gewonnen werden, ist es wichtig, diese Kulturen als eine Form der Qualitätskontrolle richtig zu aktivieren, um ihre fermentativen Eigenschaften zu verbessern8. In dieser Studie bestand das Ziel darin, ein internes Qualitätskontrollprotokoll für die Aktivierung und das Wachstum von L. delbrueckii subsp. bulgaricus-Kulturstämmen zu entwickeln, das letztendlich ein lebensfähiges LAB-Wachstum förderte und die Fermentationsleistung und die metabolische Funktionalität von LAB-Stämmen verbesserte. Dieses Protokoll könnte letztendlich (unter Verwendung optimaler Wachstumsmedien und geeigneter Kulturbedingungen) für die Kultivierung anderer LAB-Stämme für die Fermentationsforschung sowie für industrielle Zwecke oder Bioprozessprozesse angepasst werden. Dieses LAB-Aktivierungs- und Qualitätskontrollprotokoll wird daher sicherstellen, dass überlegene lebensfähige Milchstarterkulturen erhalten werden und potenziell für verschiedene Anwendungen in der globalen Molkerei- und Lebensmittelindustrie funktionsfähig sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Ergebnisse aller Stämme, die mit dem Qualitätskontrollprotokoll und ohne die Verwendung des Protokolls bewertet wurden, waren die gleichen, und als solche wurden Ergebnisse präsentiert, die nur mit Stämmen (S9 und LB6) verknüpft waren. Die aktivierten LAB-Stämme hatten ein überlegenes Zellwachstum, das durch eine hohe Intensität der Zellbiomasse gekennzeichnet war, was zu einem trüben Aussehen der MRS-fermentativen Brühe im Reagenzglasführte 11. Das beobachtete Zellwachstum nach der…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Veröffentlichung wurde durch die Fördernummer NC ermöglicht. X-267-5-12-170-1 vom National Institute of Food and Agriculture (NIFA) und teilweise von NIZO Food Research BV, Niederlande, Jarrow Formulas, USA, und dem Department of Family and Consumer Sciences und der Agriculture Research Station der North Carolina Agriculture and Technical State University (Greensboro, NC, USA 27411). Diese Arbeit wurde teilweise auch durch das 1890 Capacity Building Program Grant Nr. (2020-38821-31113 / Project Accession No. 021765) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch teilweise vom bulgarischen Ministerium für Bildung und Wissenschaft im Rahmen des Nationalen Forschungsprogramms “Gesunde Lebensmittel für eine starke Bioökonomie und Lebensqualität” unterstützt, das von DCM # 577 / 17.08.2018 genehmigt wurde.
Materials
| Aniline Blue | Thermo Scientific | R21526 | 25 g |
| Beef extract | Research Products International | 50-197-7509 | 500 g |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Calcium Chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | 500 g |
| Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP350500 | 500 g |
| D-Fructose | ACROS Organics | AC161355000 | 500 g |
| Difco agar powder | Difco | DF0812-07-1 | 2 kg |
| TPY agar | Difco | 211921 | 500 g |
| Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock) | Fisher Scientific | 05-402-12 | 2 mL |
| Glycerol | Thermo Scientific | PI17904 | 500 mL |
| Infrared CO2 Incubator | Forma Scientific | ||
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 11842 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | S9 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | LB6 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | DAW | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | E22 | |
| Lactobacillus reuteri | Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | RD2 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Maltose monohydrate | Fisher Scientific | M75-100 | 100 g |
| MRS broth | Neogen | 50-201-5691 | 5 kg |
| Peptone No. 3 | Hach | 50-199-6719 | 500 g |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Research Products International | 50-712-761 | 500 g |
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | S220-1 | 1 kg |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | 1 kg |
| Sodium pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | 100 g |
| Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps | Fisher Scientific | FB70125150 | 25 x 150 mm |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | 500 mL |
| Ultra low freezer | So-Low | ||
| Uracil | ACROS Organics | AC157301000 | 100 g |
| UV- visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Evolution 201 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | ||
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Ethanol | Fisher Scientific | T08204K7 | 4 L |
| Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical) | Fisher Scientific | SA56-500 | 500 mL |
Referencias
- Karakas-Sen, A., Karakas, E. Isolation, identification and technological properties of lactic acid bacteria from raw cow milk. Bioscience Journal. 34 (2), 385-399 (2018).
- Martin, R., Langella, P. Emerging health concepts in the probiotics field: Streamlining the definitions. Frontiers in Microbiology. 10, 1047 (2019).
- Sadishkumar, V., Jeevaratnam, K. In vitro probiotic evaluation of potential antioxidant lactic acid bacteria isolated from idli batter fermented with Piper betle leaves. International Journal of Food Science & Technology. 52 (2), 329-340 (2017).
- Ayivi, R. D., et al. Lactic acid bacteria: Food safety and human health applications. Dairy. 1 (3), 202-232 (2020).
- Quinto, E. J., et al. Probiotic lactic acid bacteria: A review. Food and Nutrition Sciences. 5 (18), 1765-1775 (2014).
- Hayek, S. A., Gyawali, R., Aljaloud, S. O., Krastanov, A., Ibrahim, S. A. Cultivation media for lactic acid bacteria used in dairy products. Journal of Dairy Research. 86 (4), 490-502 (2019).
- Bintsis, T. Lactic acid bacteria as starter cultures: An update in their metabolism and genetics. Aims Microbiology. 4, 665-684 (2018).
- Shao, Y., Gao, S., Guo, H., Zhang, H. Influence of culture conditions and preconditioning on survival of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus ND02 during lyophilization. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1270-1280 (2014).
- Aryana, K. J., Olson, D. W. A 100-year review: Yogurt and other cultured dairy products. Journal of Dairy Science. 100 (12), 9987-10013 (2017).
- Kandil, S., El Soda, M. Influence of freezing and freeze-drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains. Advances in Microbiology. 5 (6), 371-382 (2015).
- Malairuang, K., Krajang, M., Sukna, J., Rattanapradit, K., Chamsart, S. High cell density cultivation of Saccharomyces cerevisiae with intensive multiple sequential batches together with a novel technique of fed-batch at cell level (FBC). Processes. 8 (10), 1321 (2020).
- Jeanson, S., Floury, J., Gagnaire, V., Lortal, S., Thierry, A. Bacterial colonies in solid media and foods: A review on their growth and interactions with the micro-environment. Frontiers in Microbiology. 6, 1284 (2015).
- Oyeniran, A., et al. A modified reinforced clostridial medium for the isolation and enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in a mixed culture. Journal of Dairy Science. 103, 5030-5042 (2020).
- Iguchi, A., et al. Effects of repeated subculturing and prolonged storage at room temperature of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 on pulsed-field gel electrophoresis profiles. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 3079-3081 (2002).
- Hayek, S. A., Ibrahim, S. A. Current limitations and challenges with lactic acid bacteria: a review. Food and Nutrition Sciences. 4 (11), 73-87 (2013).
- Ahmed, S. A., Ibrahim, S. A., Kim, C., Shahbazi, A. Significance of bile salt tolerant Lactobacillus reuteri. Proceedings of the 2007 National Conference on Environmental Science and Technology. , 17-23 (2009).
- Gyawali, R., et al. A comparative study of extraction techniques for maximum recovery of β-galactosidase from the yogurt bacterium Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Research. 87 (1), 123-126 (2020).
- Nwamaioha, N. O., Ibrahim, S. A. A selective medium for the enumeration and differentiation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Science. 101 (6), 4953-4961 (2018).
