Facettenreiche massenspektrometrische Untersuchung von Neuropeptiden in Callinectes sapidus
Summary
Die massenspektrometrische Charakterisierung von Neuropeptiden liefert Sequenz-, Quantifizierungs- und Lokalisierungsinformationen. Dieser optimierte Workflow ist nicht nur für Neuropeptidstudien nützlich, sondern auch für andere endogene Peptide. Die hier bereitgestellten Protokolle beschreiben die Probenvorbereitung, die MS-Akquisition, die MS-Analyse und die Datenbankgenerierung von Neuropeptiden unter Verwendung von LC-ESI-MS, MALDI-MS-Spotting und MALDI-MS-Bildgebung.
Abstract
Neuropeptide sind Signalmoleküle, die fast alle physiologischen und Verhaltensprozesse wie Entwicklung, Fortpflanzung, Nahrungsaufnahme und Reaktion auf externe Stressoren regulieren. Dennoch sind die biochemischen Mechanismen und die vollständige Ergänzung der Neuropeptide und ihre funktionellen Rollen noch wenig verstanden. Die Charakterisierung dieser endogenen Peptide wird durch die immense Vielfalt innerhalb dieser Klasse von Signalmolekülen behindert. Darüber hinaus sind Neuropeptide in Konzentrationen von 100x – 1000x niedriger als die von Neurotransmittern bioaktiv und neigen nach der synaptischen Freisetzung zum enzymatischen Abbau. Die Massenspektrometrie (MS) ist ein hochempfindliches Analysewerkzeug, das Analyten ohne umfassende A-priori-Kenntnisse identifizieren, quantifizieren und lokalisieren kann. Es eignet sich gut für die globale Profilierung von Neuropeptiden und die Unterstützung bei der Entdeckung neuartiger Peptide. Aufgrund der geringen Häufigkeit und hohen chemischen Vielfalt dieser Peptidklasse wurden mehrere Probenvorbereitungsmethoden, MS-Akquisitionsparameter und Datenanalysestrategien aus Proteomiktechniken angepasst, um eine optimale Neuropeptidcharakterisierung zu ermöglichen. Hier werden Methoden zur Isolierung von Neuropeptiden aus komplexen biologischen Geweben zur Sequenzcharakterisierung, -quantifizierung und -lokalisierung mittels Flüssigkeitschromatographie (LC)-MS und matrixgestützter Laserdesorption/-ionisation (MALDI)-MS beschrieben. Ein Protokoll zur Erstellung einer Neuropeptid-Datenbank aus der blauen Krabbe, Callinectes sapidus, einem Organismus ohne umfassende genomische Informationen, ist enthalten. Diese Arbeitsabläufe können angepasst werden, um andere Klassen von endogenen Peptiden in verschiedenen Spezies mit einer Vielzahl von Instrumenten zu untersuchen.
Introduction
Das Nervensystem ist komplex und benötigt ein Netzwerk von Neuronen, um Signale durch einen Organismus zu übertragen. Das Nervensystem koordiniert sensorische Informationen und biologische Reaktionen. Die komplizierten und komplizierten Wechselwirkungen, die an der Signalübertragung beteiligt sind, erfordern viele verschiedene Signalmoleküle wie Neurotransmitter, Steroide und Neuropeptide. Da Neuropeptide die vielfältigsten und stärksten Signalmoleküle sind, die eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung physiologischer Reaktionen auf Stress und andere Reize spielen, ist es von Interesse, ihre spezifische Rolle in diesen physiologischen Prozessen zu bestimmen. Die Funktion von Neuropeptiden hängt mit ihrer Aminosäurestruktur zusammen, die die Mobilität, die Rezeptorinteraktion und die Affinitätbestimmt 1. Techniken wie die Histochemie, die wichtig ist, weil Neuropeptide in verschiedenen Regionen des Gewebes synthetisiert, gespeichert und freigesetzt werden können, und die Elektrophysiologie wurden eingesetzt, um die Struktur und Funktion von Neuropeptiden zu untersuchen 2,3,4, aber diese Methoden sind durch Durchsatz und Spezifität begrenzt, um die enorme Sequenzvielfalt von Neuropeptiden aufzulösen.
Die Massenspektrometrie (MS) ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse der Neuropeptidstruktur und -häufigkeit. Dies kann durch verschiedene MS-Techniken durchgeführt werden, am häufigsten durch Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Ionisation MS (LC-ESI-MS)5 und matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation MS (MALDI-MS)6. Durch hochgenaue Massenmessungen und MS-Fragmentierung bietet MS die Möglichkeit, Neuropeptiden aus komplexen Mischungen ohne A-priori-Kenntnisse den Status einer Aminosäuresequenz und posttranslationalen Modifikation (PTM) zuzuweisen, um ihre Funktion zu bestimmen 7,8. Neben qualitativen Informationen ermöglicht MS die quantitative Information von Neuropeptiden durch markierungsfreie Quantifizierung (LFQ) oder markierungsbasierte Methoden wie isotopische oder isobare Markierung9. Zu den Hauptvorteilen von LFQ gehören die Einfachheit, die niedrigen Analysekosten und die Verringerung der Probenvorbereitungsschritte, wodurch der Probenverlust minimiert werden kann. Zu den Nachteilen von LFQ gehören jedoch erhöhte Gerätezeitkosten, da mehrere technische Replikate erforderlich sind, um quantitative Fehler aufgrund von Run-to-Run-Variabilität zu beheben. Dies führt auch zu einer verminderten Fähigkeit, kleine Variationen genau zu quantifizieren. Markierungsbasierte Methoden unterliegen weniger systematischen Variationen, da mehrere Proben mit einer Vielzahl stabiler Isotope differenziell markiert, zu einer Probe kombiniert und gleichzeitig durch Massenspektrometrie analysiert werden können. Dies erhöht auch den Durchsatz, obwohl die Synthese oder der Kauf von Isotopenmarkierungen zeitaufwändig und kostspielig sein kann. Die spektrale Komplexität der Full Scan-Massenspektren (MS1) nimmt mit zunehmendem Multiplexing ebenfalls zu, was die Anzahl der einzigartigen Neuropeptide verringert, die fragmentiert und daher identifiziert werden können. Umgekehrt erhöht die isobare Markierung die spektrale Komplexität auf MS1-Ebene nicht, obwohl sie Herausforderungen für Analyten mit geringer Häufigkeit wie Neuropeptide mit sich bringt. Da die isobare Quantifizierung auf der Ebene der Fragmentionen-Massenspektren (MS2) durchgeführt wird, können Neuropeptide mit geringer Häufigkeit möglicherweise nicht quantifiziert werden, da reichlichere Matrixkomponenten für die Fragmentierung ausgewählt werden können und die ausgewählten möglicherweise nicht hoch genug sind, um quantifiziert zu werden. Mit der Isotopenmarkierung kann die Quantifizierung an jedem identifizierten Peptid durchgeführt werden.
Zusätzlich zur Identifizierung und Quantifizierung können Lokalisierungsinformationen von MS durch MALDI-MS-Bildgebung (MALDI-MSI)10 erhalten werden. Durch Rasten eines Lasers über eine Probenoberfläche können MS-Spektren zu einem Heatmap-Bild für jeden m/z-Wert kompiliert werden. Die Kartierung der transienten Neuropeptidsignalintensität in verschiedenen Regionen über Bedingungen hinweg kann wertvolle Informationen für die Funktionsbestimmungliefern 11. Die Lokalisation von Neuropeptiden ist besonders wichtig, da die Neuropeptidfunktion je nach Standort12 unterschiedlich sein kann.
Neuropeptide kommen in vivo in geringerer Häufigkeit vor als andere Signalmoleküle wie Neurotransmitter und erfordern daher empfindliche Methoden zum Nachweis13. Dies kann durch die Entfernung von Matrixkomponenten mit höherer Häufigkeit, wie z.B. Lipiden11,14, erreicht werden. Zusätzliche Überlegungen für die Analyse von Neuropeptiden müssen im Vergleich zu herkömmlichen Proteomik-Workflows angestellt werden, vor allem, weil die meisten neuropeptidomischen Analysen die enzymatische Verdauung auslassen. Dies schränkt die Softwareoptionen für die Neuropeptid-Datenanalyse ein, da die meisten mit Algorithmen erstellt wurden, die auf Proteomik-Daten und Proteinübereinstimmungen basieren, die durch Peptiddetektion informiert sind. Viele Software wie PEAKS15 eignet sich jedoch aufgrund ihrer De-novo-Sequenzierungsfunktionen besser für die Neuropeptidanalyse. Für die Analyse von Neuropeptiden müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden, angefangen von der Extraktionsmethode bis zur MS-Datenanalyse.
Die hier beschriebenen Protokolle umfassen Methoden zur Probenvorbereitung und Dimethylisotopenmarkierung, Datenerfassung und Datenanalyse von Neuropeptiden durch LC-ESI-MS, MALDI-MS und MALDI-MSI. Durch repräsentative Ergebnisse aus mehreren Experimenten wird der Nutzen und die Fähigkeit dieser Methoden zur Identifizierung, Quantifizierung und Lokalisierung von Neuropeptiden aus blauen Krabben, Callinectes sapidus, demonstriert. Um das Nervensystem besser zu verstehen, werden häufig Modellsysteme verwendet. Vielen Organismen steht kein vollständig sequenziertes Genom zur Verfügung, was eine umfassende Entdeckung von Neuropeptiden auf Peptidebene verhindert. Um diese Herausforderung zu mildern, ist ein Protokoll zur Identifizierung neuartiger Neuropeptide und zum Transkriptom-Mining zur Generierung von Datenbanken für Organismen ohne vollständige Genominformationen enthalten. Alle hier vorgestellten Protokolle können für Neuropeptidproben aus beliebigen Spezies optimiert sowie für die Analyse beliebiger endogener Peptide angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die genaue Identifizierung, Quantifizierung und Lokalisierung von Neuropeptiden und endogenen Peptiden im Nervensystem sind entscheidend für das Verständnis ihrer Funktion23,24. Die Massenspektrometrie ist eine leistungsstarke Technik, mit der all dies auch in Organismen ohne vollständig sequenziertes Genom erreicht werden kann. Die Fähigkeit dieses Protokolls, Neuropeptide aus Gewebe, das von C. sapidus durch eine Kombination von LC-ESI- und MALDI-M…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von der National Science Foundation (CHE-1710140 und CHE-2108223) und den National Institutes of Health (NIH) durch den Zuschuss R01DK071801 unterstützt. A.P. wurde zum Teil durch den NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505) unterstützt. N.V.Q. wurde zum Teil von den National Institutes of Health im Rahmen des Ruth L. Kirschstein National Research Service Award des National Heart Lung and Blood Institute an das University of Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (T32 HL007936) unterstützt. L.L. möchte die NIH-Zuschüsse R56 MH110215, S10RR029531 und S10OD025084 sowie die finanzielle Unterstützung durch eine Vilas Distinguished Achievement Professorship und eine Charles Melbourne Johnson Professorship mit Mitteln der Wisconsin Alumni Research Foundation und der University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy anerkennen.
Materials
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde – D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge – 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac – SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) – Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
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