細胞外フラックス解析を用いた単一3D微細組織スフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝の探索
Summary
これらのプロトコルは、タツノオトシゴの細胞外フラックス分析を使用して、3Dがん細胞株由来スフェロイドにおけるミトコンドリアエネルギー代謝を調べるのに役立ちます。
Abstract
スフェロイドと呼ばれる三次元(3D)細胞凝集体は、近年、 in vitro 細胞培養の最前線となっている。細胞を2次元の単一細胞単層(2D培養)として培養するのとは対照的に、スフェロイド細胞培養は、細胞外マトリックスタンパク質の発現、細胞シグナル伝達、遺伝子発現、タンパク質産生、分化、および増殖を含む、 生体内に存在する生理学的細胞アーキテクチャおよび特性を促進し、調節し、サポートする。3D培養の重要性は、腫瘍学、糖尿病、幹細胞生物学、組織工学など、多くの研究分野で認識されています。過去10年間で、スフェロイドを産生し、その代謝機能と運命を評価するための改良された方法が開発されました。
細胞外フラックス(XF)分析装置は、XF24膵島捕捉プレートまたはXFe96スフェロイドマイクロプレートのいずれかを使用して、スフェロイドなどの3Dマイクロ組織におけるミトコンドリア機能を探索するために使用されてきました。しかしながら、XF技術を用いたスフェロイドにおけるミトコンドリアエネルギー代謝のプロービングの明確なプロトコルおよび最適化は、詳細には記載されていない。この論文では、XFe96 XFアナライザーを搭載したスフェロイドマイクロプレートを使用して、単一の3Dスフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝を調べるための詳細なプロトコルを提供します。異なるがん細胞株を使用して、XF技術は、異なるサイズだけでなく、異なる体積、細胞数、DNA含量およびタイプの3Dスフェロイドにおける細胞呼吸を区別できることが実証されている。
オリゴマイシン、BAM15、ロテノン、およびアンチマイシンAの最適なミトコンドリアエフェクター化合物濃度は、3Dスフェロイドにおけるミトコンドリアエネルギー代謝の特異的パラメータをプローブするために使用される。この論文では、回転楕円体から得られたデータを正規化する方法についても説明し、XF技術を使用して回転楕円体代謝を探索する際に考慮すべき多くの考慮事項について説明します。このプロトコルは、高度な in vitro スフェロイドモデルの研究を促進するのに役立ちます。
Introduction
生物学的研究におけるin vitroモデルの進歩は、過去20年間で急速に進歩しました。このようなモデルには、臓器オンチップモダリティ、オルガノイド、および3Dマイクロ組織スフェロイドが含まれ、これらはすべて、in vitroおよびin vivo研究間の翻訳を改善するための共通の焦点となっている。高度なin vitroモデル、特にスフェロイドの使用は、組織工学、幹細胞研究、癌、および疾患生物学1,2,3,4,5,6,7、および遺伝毒物学8,9,10、ナノ材料毒物学11を含む安全性試験を含むいくつかの研究分野にまたがり、 12、13、14、および薬物安全性および有効性試験8、15、16、17、18、19。
正常な細胞形態は、生物学的表現型および活性にとって重要である。細胞を3Dマイクロティッシュスフェロイドに培養することで、細胞は形態、表現型機能、およびアーキテクチャを採用することができ、 これは生体内で 観察されるものに似ていますが、古典的な単層細胞培養技術では捕捉が困難です。 インビボ および インビトロ の両方で、細胞機能は、細胞のコミュニケーションおよびプログラミング(例えば、細胞 – 細胞接合の形成、細胞ニッチを形成する機会)に限定されない細胞微小環境によって直接影響を受ける。即時環境におけるホルモンおよび成長因子への細胞曝露(例えば、炎症反応の一部としての細胞サイトカイン曝露);物理的および化学的マトリックスの組成(例えば、細胞が硬い組織培養プラスチックまたは弾性組織環境で増殖されるかどうか);そして最も重要なのは、細胞代謝が栄養と酸素へのアクセス、ならびに乳酸などの代謝性老廃物の処理によってどのように影響を受けるかということです。
代謝フラックス分析は、定義された in vitro システム内の細胞代謝を調べるための強力な方法です。具体的には、XF技術は、無傷の細胞および組織の細胞生体エネルギーの生きたリアルタイム変化の分析を可能にする。多くの細胞内代謝事象が数秒から数分のオーダーで起こることを考えると、イン ビトロで無傷の細胞および組織における細胞代謝フラックスのリアルタイム変化を理解するためには、リアルタイムの機能的アプローチが最も重要である。
本論文では、強制凝集アプローチを用いた in vitro 3Dスフェロイドモデルとして、がん由来細胞株A549(肺腺がん)、HepG2/C3A(肝細胞がん)、MCF-7(乳腺がん)、SK-OV-3(卵巣腺がん)を培養するためのプロトコルを提供する(図1)。また、(i)Agilent XFe96 XFアナライザーを使用して単一の3Dスフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝を調べる方法を詳細に説明し、(ii)単一の3Dスフェロイドを使用してXFアッセイを最適化する方法を強調し、(iii)このアプローチを使用して3Dスフェロイド代謝をプローブする重要な考慮事項と制限について説明します。最も重要なのは、この論文では、酸素消費速度(OCR)の計算が酸化的リン酸化を決定し、したがって細胞スフェロイドのミトコンドリア機能を決定することを可能にするデータセットがどのように収集されるかを説明する。このプロトコールについては分析されていないが、細胞外酸性化率(ECAR)は、XF実験においてOCRデータとともに測定される別のパラメータである。ただし、ECAR は XF データセットから不適切または誤って解釈されることがよくあります。テクノロジーメーカーの基本的なアプローチに従ってECARを計算することの限界について解説します。
Protocol
図1:細胞スフェロイドの生成、細胞外フラックス分析、ダウンストリームアッセイのグラフィカルワークフロー。4つの癌細胞株を単層(A)として選択的に培養し、組織培養フラスコから剥離し、超低付着96ウェルマイクロプレートに播種してスフェロ?…
Representative Results
十分に形成されたコンパクトなスフェロイドを得るために、各細胞株を播種密度および培養期間について個別に最適化した(図3)。A549、HepG2/C3A、およびSK-OV-3細胞株は、最初に緩い凝集体を形成し、培養7日後まで周囲が明確に定義された丸いスフェロイドに進行しなかった。逆に、MCF-7細胞は3日以内にスフェロイドを形成することができた。すべてのスフェロイドモデル?…
Discussion
主な調査結果と成果
この論文では、XFe96 XF Analyzerを搭載した一連のがん由来細胞株を使用して、単一の3Dスフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝を調べるための詳細なプロトコルを提供します。強制凝集のための細胞忌避技術を用いて、A549、HepG2/C3A、MCF7、およびSK-OV-3細胞スフェロイドの迅速な培養のための方法が開発され、記述されている。このプロトコルは、(1)スフ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
N.J.C.は、Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003) と共に BBSRC MIBTP CASE Award の支援を受けました。
Materials
| A549 | ECACC | #86012804 | Lung carcinoma cell line |
| Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 | Agilent Technologies Inc. | 103576-100 | XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate |
| Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Agilent Technologies Inc. | – | Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids |
| Antimycin A | Merck Life Science | A8674 | Mitochondrial respiratory complex III inhibitor |
| BAM15 | TOCRIS bio-techne | 5737 | Mitochondrial protnophore uncoupler |
| Black-walled microplate | Greiner Bio-One | 655076 | For fluorescence-based assays |
| CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates | Greiner Bio-One | 650970 | Microplates for generating spheroids |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D Systems a biotechne brand | 3439-100-01 | Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids |
| D-(+)-Glucose | Merck Life Sciences | G8270 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885084 | Culture medium for HepG2/C3A spheroids |
| EVOS XL Core Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | Phase-contrast imaging microscope |
| EZ-PCR Mycoplasma test kit | Biological Industries | 20-700-20 | Mycoplasma screening in cell cultures |
| FIJI Is Just Image J | Analysis of collated images | ||
| Foetal bovine serum | Merck Life Science | F7524 | Supplement for cell culture medium |
| HepG2/C3A | ATCC | #CRL-10741 | Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line |
| Lactate-Glo | Promega | J5021 | Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium |
| L-glutamine (200 mM solution) | Merk Life Sciences | G7513 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| M50 Stereo microscope | Leica Microsytems | LEICAM50 | Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling |
| MCF-7 | ECACC | #86012803 | Breast adenocarcinoma cell line |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Merck Life Science | O4876 | ATP Synthase Inhibitor |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics added to cell culture medium |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Initrogen | P7589 | Analysis of dsDNA in spehroids |
| Rotenone | Merck Life Science | R8875 | Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875091 | Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids |
| Seahorse Analytics | Agilent Technologies Inc. | Build 421 | https://seahorseanalytics.agilent.com |
| Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak | Agilent Technologies Inc. | 102905-100 | Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000) |
| Serological pipette: 5, 10, and 25 mL | Greiner Bio-One | 606107; 607107; 760107 | Consumables for cell culture |
| SK-OV-3 | ECACC | #HTB-77 | Ovarian adenocarcinoma cell line |
| Sodium pyruvate (100 mM solution) | Merck Life Science | S8636 | Supplement for cell culture growth and XF assay medium |
| T75 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 658175 | Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures |
| TrypLExpress | Gibco | 12604-021 | Cell dissociation reagent |
| Wave controller software | Agilent Technologies Inc. | – | |
| Wide orifice tip | STARLAB International GmbH | E1011-8400 | Pipette tips with wide opening for spheroid handling |
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Citar este artículo
Coltman, N. J., Rochford, G., Hodges, N. J., Ali-Boucetta, H., Barlow, J. P. Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (180), e63346, doi:10.3791/63346 (2022).