Aangepaste techniek voor het gebruik van neonatale muizenharten in het Langendorff-preparaat
Summary
Het huidige protocol beschrijft aortacantnulatie en retrograde perfusie van het ex-vivo neonatale muizenhart. Een tweepersoonsstrategie, met behulp van een ontleedmicroscoop en een stompe kleine naald, maakt betrouwbare cannulatie mogelijk. Kwantificering van longitudinale contractiele spanning wordt bereikt met behulp van een krachttransducer die is verbonden met de top van de linker ventrikel.
Abstract
Het gebruik van het ex-vivo retrograde doordrenkte hart is al lang een hoeksteen van ischemie-reperfusieonderzoek sinds de ontwikkeling ervan door Oskar Langendorff meer dan een eeuw geleden. Hoewel deze techniek de afgelopen 25 jaar op muizen is toegepast, is het gebruik ervan bij deze soort beperkt tot volwassen dieren. De ontwikkeling van een succesvolle methode om de neonatale muriene aorta consequent te cannuleren, zou de systematische studie van het geïsoleerde retrograde doordrenkte hart mogelijk maken tijdens een kritieke periode van cardiale ontwikkeling in een genetisch aanpasbare en goedkope soort. Modificatie van het Langendorff-preparaat maakt cannulatie en reperfusie in het neonatale muizenhart mogelijk, terwijl de ischemische tijd wordt geminimaliseerd. Optimalisatie vereist een techniek voor twee personen om succesvolle cannulatie van de pasgeboren muisaorta mogelijk te maken met behulp van een ontleedmicroscoop en een gemodificeerde commercieel verkrijgbare naald. Het gebruik van deze aanpak zal op betrouwbare wijze retrograde perfusie binnen 3 minuten tot stand brengen. Omdat de kwetsbaarheid van het neonatale muizenhart en de grootte van de ventriculaire holte directe meting van de intraventriculaire druk die met een ballon wordt gegenereerd, verhindert, is het gebruik van een krachttransducer die door een hechting verbonden is met de top van de linker ventrikel om de longitudinale contractiele spanning te kwantificeren noodzakelijk. Deze methode stelt onderzoekers in staat om met succes een geïsoleerde constante stroom retrograde-perfused pasgeboren murine hartvoorbereiding vast te stellen, waardoor de studie van ontwikkelings-cardiale biologie op een ex-vivo manier mogelijk wordt. Belangrijk is dat dit model een krachtig hulpmiddel zal zijn om de fysiologische en farmacologische reacties op ischemie-reperfusie in het neonatale hart te onderzoeken.
Introduction
Ex-vivo hartpreparaten zijn al meer dan een eeuw een hoofdbestanddeel van fysiologische, pathofysiologische en farmacologische studies. Voortkomend uit het werk van Elias Cyon in de jaren 1860, paste Oskar Langendorff het geïsoleerde kikkermodel aan voor retrograde perfusie, waarbij de aortawortel onder druk werd gezet om coronaire stroom te voorzien van een zuurstofrijk perfusaat1. Met behulp van zijn aanpassing kon Langendorff een correlatie aantonen tussen coronaire circulatie en mechanische functie2. Het ex-vivo retrograde doordrenkte hart, later gelijknamig de Langendorff-techniek genoemd, is een hoeksteen van fysiologisch onderzoek gebleven, waarbij het zijn eenvoud gebruikt om het geïsoleerde hart krachtig te bestuderen in afwezigheid van potentiële confounders. Het Langendorff-preparaat is verder aangepast om het hart te laten uitstoten (het zogenaamde “werkhart”) en het perfusaat te laten recirculeren3. De primaire fysiologische eindpunten van belang zijn echter onveranderd gebleven. Dergelijke eindpunten omvatten metingen van contractiele functie, elektrische geleiding, hartmetabolisme en coronaireweerstand 4.
Om de hartfunctie in zijn oorspronkelijke kikkerhartpreparaat te evalueren, mat Langendorff de spanning die werd gegenereerd door ventriculaire contractie in de lengteas met behulp van een hechtdraad verbonden tussen de top van het hart en een krachttransducer. 5 Isometrische contractie werd op deze manier gekwantificeerd met basale spanning op het hart bij afwezigheid van ventriculaire vulling. Verfijning van de aanpak heeft geleid tot met vloeistof gevulde ballonnen die via het linkeratrium in de linker ventrikel zijn geplaatst om de myocardiale prestaties tijdens isovolumische contractiete evalueren 6. Om het hartritme en de hartslag te beoordelen, kunnen oppervlaktekabels op de polen van het hart worden geplaatst om onderzoekers in staat te stellen het elektrocardiogram op te nemen. Relatieve bradycardie kan echter worden verwacht, gezien de verplichte denervatie. Extrinsieke pacing kan dienen om dit te overwinnen en hartslagvariabiliteit tussen experimenten te elimineren1. Een andere uitkomstmaat, het myocardiale metabolisme, kan worden beoordeeld door het zuurstof- en metabole substraatgehalte in het coronaire perfusaat en effluent te meten en het verschil tussen hen te berekenen7. Lactaatkwantificering in het coronaire effluent kan helpen bij het karakteriseren van perioden van anaeroob metabolisme, zoals wordt gezien bij hypoxie, hypoperfusie, ischemie-reperfusie of metabole verstoringen7.
Het oorspronkelijke werk van Langendorff maakte de studie van het ex-vivo zoogdierhart mogelijk, met katten als primaire proefpersoon5. Evaluatie van het geïsoleerde rattenhart werd populair in het midden van de jaren 1900 met Howard Morgan, die het ‘werkhart’ ratmodel in 1967 beschreef5. Het gebruik van muizen begon pas 25 jaar geleden vanwege de technische complexiteit, weefselfragiliteit en relatief kleine muizenhartgrootte. Ondanks de uitdagingen die gepaard gaan met muizenstudie, hebben de lagere kosten en het gemak van genetische manipulatie de aantrekkingskracht en vraag van dergelijke muizen ex-vivo preparaten vergroot. Helaas is de toepassing van de techniek beperkt gebleven tot volwassen dieren, waarbij juveniele muizen van 4 weken oud de jongste proefpersonen zijn die tot voor kort voor ex-vivostudie zijn gebruikt 8,9. Hoewel juveniele muizen “relatief onvolwassen” zijn in vergelijking met volwassenen, is hun nut als proefpersonen voor ontwikkelingsbiologiestudies beperkt omdat ze over het algemeen zijn gespeend van hun geboortemoeder en binnenkort in de puberteit10 zullen beginnen. Adolescentie vindt plaats tot ver na de postnatale overgang in myocardiaal substraatgebruik van glucose en lactaat naar vetzuren11. De meeste informatie over de metabole veranderingen in het neonatale hart is dus historisch gezien het resultaat van ex-vivo werk bij grotere soorten zoals konijnen en cavia11.
Er bestaan inderdaad alternatieve benaderingen voor het Langendorff-preparaat. Deze omvatten in vitro experimenten, waarbij de volledige functionele gegevens en context van het orgaan ontbreken, of in vivo studies. Dit kan technisch uitdagend en gecompliceerd zijn door verstorende variabelen zoals de cardiovasculaire en respiratoire effecten van een vereist anestheticum, de invloed van neurohumorale input, de gevolgen van de kerntemperatuur, de voedingsstatus van het dier en de beschikbaarheid van het substraat12,13. Omdat de Langendorff-benadering de studie van het geïsoleerde hart op een ex-vivo manier op een meer gecontroleerde manier mogelijk maakt in afwezigheid van dergelijke confounders, is en blijft het beschouwd als een krachtig onderzoeksinstrument. Daarom geeft de hier gepresenteerde techniek onderzoekers een experimentele benadering voor de ex-vivo studie van het pasgeboren muizenhart en beperkt het de tijd tot reperfusie.
Het onderzoeken van het hart tijdens perioden van ontwikkeling is een belangrijke overweging gezien de brede biochemische, fysiologische en anatomische overgangen die optreden tijdens myocardiale rijping. Verschuivingen van anaeroob metabolisme naar oxidatieve fosforylering, veranderingen in substraatgebruik en progressie van celproliferatie naar hypertrofie zijn dynamische processen die uniek voorkomen in het onvolgroeide hart11,14. Een ander cruciaal aspect van het zich ontwikkelende hart is dat stressoren die tijdens noodzakelijke perioden worden aangetroffen, verhoogde reacties in het pasgeboren hart kunnen veroorzaken en de toekomstige gevoeligheid voor beledigingen op volwassen leeftijd kunnen veranderen15. Hoewel eerder werk pasgeboren ratten, lammeren en konijnen heeft gebruikt om het door Langendorff doordrenkte neonatale hart te bestuderen, zijn vorderingen die het gebruik van muizen toestaan noodzakelijk gezien het belang van deze soort voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek16. Om aan deze behoefte te voldoen, werd onlangs het eerste muizen-Langendorff-doordrenkte pasgeboren hartmodel met 10 dagen oude dieren opgericht6. Hier gepresenteerd is een methode om succesvolle aorta-cannulatie mogelijk te maken en retrograde perfusie van het geïsoleerde pasgeboren muizenhart tot stand te brengen. Deze aanpak kan worden gebruikt voor farmacologie, ischemie-reperfusie of metabolismestudies gericht op de gehele orgaanfunctie of kan worden aangepast voor de isolatie van cardiomyocyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige werk beschrijft succesvolle aorta-cannulatie en retrograde perfusie in het geïsoleerde pasgeboren muizenhart. Belangrijk is dat het onderzoekers in staat stelt om de barrières te overwinnen die jonge muizenleeftijd en kleine hartgrootte eerderpresenteerden 8. Hoewel niet complex in ontwerp, vereist de aanpak wel een aanzienlijke mate van technische vaardigheid. Belangrijke stappen die zelfs de meest technisch bekwame onderzoekers onvermijdelijk zullen uitdagen, zijn cannulatie van de…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH/NINDS R01NS112706 (R.L.)
Materials
| Rodent Langendorff Apparatus | Radnoti | 130102EZ | |
| 24 G catheter | BD | 381511 | |
| 26 G needle on 1 mL syringe combo | BD | 309597 | |
| 26 G steel needle | BD | 305111 | |
| 5-0 Silk Suture | Ethicon | S1173 | |
| Bio Amp | ADInstruments | FE135 | |
| Bio Cable | ADInstruments | MLA1515 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| Circulating heating water Bath | Haake | DC10 | |
| curved iris scissor | Medline | MDS10033Z | |
| dissecting microscope | Nikon | SMZ-2B | |
| find spring scissors | Kent | INS600127 | |
| Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Heparin | Sagent | 400-01 | |
| High pressure tubing | Edwards Lifesciences | 50P184 | |
| iris dressing forceps | Kent | INS650915-4 | |
| Jeweler-style curved fine forceps | Miltex | 17-307-MLTX | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911-25G | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-25G | |
| Roller Pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| straight dissecting scissors | Kent | INS600393-G | |
| Temporary cardiac pacing wire | Ethicon | TPW30 | |
| Wide Range Force Transducer | ADInstruments | MLT1030/A |
Referencias
- Bell, R., Mocanu, M., Yellon, D. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szeląg, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Olejnickova, V., Novakova, M., Provaznik, I. Isolated heart models: Cardiovascular system studies and technological advances. Medical and Biological Engineering and Computing. 53 (7), 669-678 (2015).
- Döring, H. The isolated perfused heart according to Langendorff technique–function–application. Physiologia Bohemoslovaca. 39 (6), 481-504 (1990).
- Liao, R., Podesser, B., Lim, C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: New advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).
- Barajas, M., Yim, P., Gallos, G., Levy, R. An isolated retrograde-perfused newborn mouse heart preparation. MethodsX. 7, 101058 (2020).
- De Leiris, J., Harding, D., Pestre, S. The isolated perfused rat heart: A model for studying myocardial hypoxia or ischaemia. Basic Research in Cardiology. 79 (3), 313-321 (1984).
- Liaw, N., et al. Postnatal shifts in ischemic tolerance and cell survival signaling in murine myocardium. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 305 (10), 1171-1181 (2013).
- Chaudhary, K., et al. Differential effects of soluble epoxide hydrolase inhibition and CYP2J2 overexpression on postischemic cardiac function in aged mice. Prostaglandins and Other Lipid Mediators. 104, 8-17 (2013).
- Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sciences. 152, 244-248 (2016).
- Onay-Besikci, A. Regulation of cardiac energy metabolism in newborn. Molecular and Cellular Biochemistry. 287 (1), 1-11 (2006).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: Advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: A matter of size. Frontiers in Physiology. 3 (345), 00345 (2012).
- Tan, C., Lewandowski, A. The transitional heart: From early embryonic and fetal development to neonatal life. Fetal Diagnosis and Therapy. 47 (5), 373-386 (2020).
- Zhang, P., Lv, J., Li, Y., Zhang, L., Xiao, D. Neonatal lipopolysaccharide exposure gender-dependently increases heart susceptibility to ischemia/reperfusion injury in male rats. International Journal of Medical Sciences. 14 (11), 1163 (2017).
- Ziyatdinova, N., et al. Effect of If Current Blockade on Newborn Rat Heart Isolated According to Langendorff. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 167 (4), 424-427 (2019).
- Teng, B., Tilley, S., Ledent, C., Mustafa, S. In vivo assessment of coronary flow and cardiac function after bolus adenosine injection in adenosine receptor knockout mice. Physiological reports. 4 (11), 12818 (2016).
- Xu, W., et al. Lethal cardiomyopathy in mice lacking transferrin receptor in the heart. Cell Reports. 13 (3), 533-545 (2015).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: Anesthetic considerations in preclinical research. Institute for Laboratory Animal Research. 53 (1), 55-69 (2012).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: Anesthetic considerations in preclinical research. ILAR Journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blümel, G. A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone, ketamine-xylazine, carfentanyl-etomidate). Research in Experimental Medicine. 184 (3), 159-169 (1984).
- Janssen, B., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).
- Zuurbier, C., Koeman, A., Houten, S., Hollmann, M., Florijn, W. Optimizing anesthetic regimen for surgery in mice through minimization of hemodynamic, metabolic, and inflammatory perturbations. Experimental Biology and Medicine. 239 (6), 737-746 (2014).
- Hard, G. Thymectomy in the neonatal rat. Laboratory Animals. 9 (2), 105-110 (1975).
- Sun, Z., Ambrosi, E., Bricalli, A., Ielmini, D. Logic computing with stateful neural networks of resistive switches. Advanced Materials. 30 (38), 1802554 (2018).
- Clancy, B., Finlay, B., Darlington, R., Anand, K. Extrapolating brain development from experimental species to humans. Neurotoxicology. 28 (5), 931-937 (2007).
- Hornig, M., Chian, D., Lipkin, W. Neurotoxic effects of postnatal thimerosal are mouse strain dependent. Molecular Psychiatry. 9 (9), 833-845 (2004).
- Langendorff, O. Untersuchungen am überlebenden Säugethierherzen. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 61 (6), 291-332 (1895).
- Edlund, A., Wennmalm, &. #. 1. 9. 7. ;. Oxygen consumption in rabbit Langendorff hearts perfused with a saline medium. Acta Physiologica Scandinavica. 113 (1), 117-122 (1981).
- Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Wengrowski, A., Kay, M. Oxygen demand of perfused heart preparations: How electromechanical function and inadequate oxygenation affect physiology and optical measurements. Experimental Physiology. 100 (6), 603-616 (2015).
- Wiesmann, F., et al. Developmental changes of cardiac function and mass assessed with MRI in neonatal, juvenile, and adult mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 278 (2), 652-657 (2000).
- Le, V., Kovacs, A., Wagenseil, J. Measuring left ventricular pressure in late embryonic and neonatal mice. Journal of visualized experiments. (60), e3756 (2012).
- Bednarczyk, J., et al. Incorporating dynamic assessment of fluid responsiveness into goal-directed therapy: A systematic review and meta-analysis. Critical Care Medicine. 45 (9), 1538 (2017).
- Louch, W., Sheehan, K., Wolska, B. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Ackers-Johnson, M., Foo, R. Langendorff-free isolation and propagation of adult mouse cardiomyocytes. Methods in Molecular Biology. 1940, 193-204 (2019).
- Peng, Y., Buller, C., Charpie, J. Impact of N-acetylcysteine on neonatal cardiomyocyte ischemia-reperfusion injury. Pediatric Research. 70 (1), 61-66 (2011).
- Jarmakani, J., Nakazawa, M., Nagatomo, T., Langer, G. Effect of hypoxia on mechanical function in the neonatal mammalian heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 235 (5), 469-474 (1978).
- Podesser, B., Hausleithner, V., Wollenek, G., Seitelberger, R., Wolner, E. Langendorff and ischemia in immature and neonatal myocardia: Two essential key-words in Today’s cardiothoracic research. Acta Chirurgica Austriaca. 25 (6), 434-437 (1993).
- Popescu, M., et al. Getting an early start in understanding perinatal asphyxia impact on the cardiovascular system. Frontiers in Pediatrics. 8, 68 (2020).
