ייצור והרחבה של קווי גידול ראשוניים וממאירים במליאה של Pleural
Summary
מטרת מאמר שיטה זה היא להדגים מתודולוגיה חזקה וניתנת לשחזור להעשרה, יצירה והרחבה של קווי תאי הגידול הראשוניים ממזותליומה של pleural שנכרתה בניתוח.
Abstract
חסרות מתודולוגיות עדכניות להרחבת קווי תאי הגידול הראשוניים מסוגי גידולים נדירים. פרוטוקול זה מתאר שיטות להרחבת תאי הגידול הראשוניים ממזותליומה של pleural (MPM) שעברה כריתה כירורגית וממאירה על ידי מתן סקירה מלאה של התהליך מעיכול להעשרה, הרחבה, שימור בהקפאה ואפיון פנוטיפי. בנוסף, פרוטוקול זה מציג מושגים ליצירת גידולים שעשויים להיות שימושיים עבור סוגי גידולים מרובים כגון טריפסיניזציה דיפרנציאלית והשפעת שיטות הדיסוציאציה על זיהוי סמני פני השטח של התא לאפיון פנוטיפי. המגבלה העיקרית של מחקר זה היא בחירת תאי הגידול שיתרחבו במערכת תרביות דו-ממדית (דו-ממדית). וריאציות לפרוטוקול זה, כולל מערכות תרביות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות), תוספי מדיה, ציפוי צלחת לשיפור ההידבקות ושיטות פירוק חלופיות, יכולות לשפר טכניקה זו ואת שיעור ההצלחה הכולל של הקמת קו גידול. באופן כללי, פרוטוקול זה מספק שיטת בסיס לביסוס ואפיון תאי גידול מגידול נדיר זה.
Introduction
מזותליומה ממאירה (MPM) היא גידול נדיר הקשור מאוד לחשיפה לאסבסט. למרות שגישות מבוססות אימונותרפיה הראו תוצאות מעודדות, יש מחסור באפשרויות הטיפול הזמינות לחולים המפתחים מחלה זו, ושיעור ההישרדות הכולל ל-5 שנים נמוךב-1,2. במוסדות רבים נעשים מאמצים להבין טוב יותר את המחלה ולזהות מטרות טיפוליות חדשניות שעשויות לשפר את תוצאות המטופלים. בעוד ישנם מודלים מרובים של עכברי מזותליומה, הגישה לתאי גידול מזותליומה ראשוניים מוגבלת יותר3. הרחבה במבחנה של תאי גידול ראשוניים של מזותליומה תספק מערכת מודל רבת ערך שניתן להשתמש בה כדי לחקור את תאי הגידול ישירות ואת האינטראקציה שלהם עם תאי חיסון אוטולוגיים כגון לימפוציטים המסתננים לגידול. אמנם היו דיווחים על התרחבות של קווי תאים סרטניים ראשוניים של מזותליומה, אך אלה מעטים ואינם מספקים הליך פעולה סטנדרטי מפורט (SOP). יתר על כן, מעט שורות תאים זמינות ממקורות מסחריים כגון אוסף תרביות מסוג אמריקאי (ATCC). בעוד שהזמינות של קווי הגידול הראשוניים מוגבלת, הוכח כי ניתן להרחיב את תאי הגידול מהתפרצויות pleural ישירות מרקמת הגידול 4,5. בנוסף, הודגם כי קווי תאים מורחבים של הגידול משמרים את הפרופיל המולקולרי של הגידול המקורי 4,5,6.
המעבדה שלנו חוקרת את המיקרו-סביבה החיסונית-גידולית של MPM ופיתחה שיטה להרחבת קווי תאי הגידול הראשוניים של MPM ממקרים שעברו כריתה כירורגית. שיטה זו מותאמת מניסיוננו בהקמת קווי תאים ראשוניים של גידול מלנומה גרורתית. מטרת עבודה זו היא לספק גישה מפורטת ומעשית להרחבת קו הגידול הראשוני של מזותליומה באמצעות מערכת מודל דו-ממדית ופרופיל פנוטיפי לאחר מכן. בהתחשב בהצלחה האחרונה של אסטרטגיות חסימת מחסום המכוונות נגד CTLA4 ו- PD-1 בהגדרת קו ראשון2, היכולת ליצור קווי גידול ראשוניים רבים יכולה לקדם את ההבנה של שני מנגנוני ההתנגדות הפנימיים של הגידול, כמו גם לספק מערכת מודל חשובה להערכת זיהוי תאי T, ובכך להעמיק את הבנתנו את התגובה החיסונית ב- MPM.
המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא שכל גידול מכיל מיקרו-סביבה שונה, ויש רמה גבוהה של שונות של הצלחת ההתרחבות. בנוסף, שיטה זו בוחרת עבור תאים סרטניים שיכולים להתרחב במערכת תרבית דו-ממדית. שיטות אחרות הכוללות ייצור של תרבית ספרואידית או אורגנואידית תלת-ממדית יכולות לספק גישה חלופית שעשויה לאפשר שיעור הצלחה גבוה יותר של התפשטות או לגרום ליכולת להפיק קווי תאים שאינם מסוגלים להתרחב במערכת דו-ממדית מסורתית. תרביות תלת מימד כאלה הוכחו כמועילות ליצירת סוגי גידולים שקשה להרחיב, למשל, סרטן הלבלב7.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד שפרוטוקול זה הוא פשוט, ישנם כמה צעדים קריטיים שיש לעקוב אחריהם מקרוב. ההקפאה של המעבר המוקדם חשובה כדי לשמר את היכולת לחזור על תהליך העשרת תאי הגידול אם בתחילה לא הצליח. היכולת להעריך זיהום פיברובלסטי בעין כדי להחליט על טכניקת הפיצול והרעב התקשורתי הנכונה היא חיונית למניעת צמיחת יתר ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לראקל לאזה-בריוויסקה על תרומתה להתחלת פרוטוקול זה ולד”ר בוריס ספסי, רזא מהרן ודיוויד רייס על שיתוף הפעולה באיסוף רקמות. אין מימון נוסף הקשור לעבודה זו.
Materials
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
Referencias
- Guzman-Casta, J., et al. Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma. Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).
- Baas, P., et al. First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).
- Testa, J. R., Berns, A. Preclinical models of malignant mesothelioma. Frontiers in Oncology. 10, 101 (2020).
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Kobayashi, M., Takeuchi, T., Ohtsuki, Y. Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status. Anticancer Research. 28 (1), 197-208 (2008).
- Chernova, T., et al. Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease. Cell Death and Differentiation. 23 (7), 1152-1164 (2016).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Han, A. C., et al. Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E-cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Human Pathology. 28 (6), 641-645 (1997).
- Tachibana, K. N-cadherin-mediated aggregate formation; cell detachment by Trypsin-EDTA loses N-cadherin and delays aggregate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (2), 414-418 (2019).
- Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment. Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).
- Pham, K., et al. Isolation of pancreatic cancer cells from a patient-derived xenograft model allows for practical expansion and preserved heterogeneity in culture. American Journal of Pathology. 186 (6), 1537-1546 (2016).
- Derycke, L. D., Bracke, M. E. N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling. International Journal of Developmental Biology. 48 (5-6), 463-476 (2004).
