El cribado de interferencia de ARN (ARNi) de alto rendimiento utilizando un grupo de shRNAs lentivirales puede ser una herramienta para detectar dianas letales sintéticas terapéuticamente relevantes en neoplasias malignas. Proporcionamos un enfoque de detección de ARNt agrupado para investigar los efectores epigenéticos en la leucemia mieloide aguda (LMA).
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Artículo de método
Cribado agrupado de la biblioteca de shRNA para identificar los factores que modulan un fenotipo de resistencia a los medicamentos
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Resumen
Resumen
Comprender los mecanismos impulsores clínicamente relevantes de la quimiorresistencia adquirida es crucial para dilucidar las formas de eludir la resistencia y mejorar la supervivencia en pacientes con leucemia mieloide aguda (LMA). Una pequeña fracción de las células leucémicas que sobreviven a la quimioterapia tienen un estado epigenético preparado para tolerar el insulto quimioterapéutico. La exposición adicional a la quimioterapia permite que estas células persistentes de medicamentos alcancen un estado epigenético fijo, lo que conduce a una expresión génica alterada, lo que resulta en la proliferación de estas poblaciones resistentes a los medicamentos y, finalmente, en una recaída o enfermedad refractaria. Por lo tanto, es fundamental identificar las modulaciones epigenéticas que requieren la supervivencia de las células leucémicas resistentes a los medicamentos. Detallamos un protocolo para identificar moduladores epigenéticos que median la resistencia a la citarabina analógica de nucleósidos (AraC) utilizando el cribado de la biblioteca de SHRNA agrupado en una línea celular de LMA adquirida resistente a la citarabina. La biblioteca consta de 5.485 construcciones de shRNA dirigidas a 407 factores epigenéticos humanos, lo que permite la detección del factor epigenético de alto rendimiento.
Introducción
Las opciones terapéuticas en la leucemia mieloide aguda (LMA) se han mantenido sin cambios durante casi las últimas cinco décadas, con la citarabina (AraC) y las antraciclinas como la piedra angular para el tratamiento de la enfermedad. Uno de los desafíos para el éxito de la terapia con LMA es la resistencia de las células madre leucémicas a la quimioterapia, lo que lleva a la recaída de la enfermedad 1,2. La regulación epigenética juega un papel vital en la patogénesis del cáncer y la resistencia a los medicamentos, y varios factores epigenéticos han surgido como objetivos terapéuticos prometedores
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Protocolo
Siga las pautas del Comité Institucional de Bioseguridad (IBSC) y use la instalación adecuada para manejar el lentivirus (BSL-2). El personal debe estar debidamente capacitado en el manejo y eliminación de lentivirus. Este protocolo sigue las pautas de bioseguridad de Christian Medical College, Vellore.
1. Selección del promotor más potente para obtener una expresión persistente y prolongada de los shRNAs
NOTA: Es imprescindible realizar un experimento de transducción utilizando vectores lentivirales con diferentes promotores que expresan proteínas de fluorescencia para identificar el promotor que ....
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Resultados
El flujo de trabajo de filtrado general se muestra en la Figura 1A. La citotoxicidad in vitro del MV4-11 AraC R (48 h) reveló que el IC50 a citarabina en el MV4-11 AraC R era mayor que el MV4-11 P (Figura 1B). Esta línea celular se utilizó en el estudio como modelo para el cribado de los factores epigenéticos responsables de la resistencia a la citarabina.
La Figura 2A muestra lo.......
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Discusión
La interferencia de ARN (ARNi) se utiliza ampliamente para estudios de genómica funcional, que incluyen la detección de siRNA y shRNA. El beneficio de los shRNA es que pueden incorporarse a vectores plásmidos e integrarse en el ADN genómico, lo que resulta en una expresión estable y, por lo tanto, un derribo más prolongado del ARNm objetivo. Un cribado de biblioteca de shRNA agrupado es robusto y rentable en comparación con los cribados convencionales (siRNA). Identificar la esencialidad de una clase específica de proteí.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses y nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio está financiado en parte por una subvención del Departamento de Biotecnología BT/PR8742/AGR/36/773/2013 a SRV; y Departamento de Biotecnología de la India BT/COE/34/SP13432/2015 y Departamento de Ciencia y Tecnología de la India: EMR/2017/003880 a P.B. RVS y P.B. cuentan con el apoyo de Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 e IA/S/15/1/501842, respectivamente. S.D. cuenta con el apoyo de la beca CSIR-UGC, y S.I. cuenta con el apoyo de una beca de investigación senior de ICMR. Agradecemos a Abhirup Bagchi, Sandya Rani y al personal de CSCR Flow Cytometry Core Facility por su ayuda. También agradecemos a MedGenome Inc. por ayudar con la secuenciación....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| 100 bp Escalera Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Escalera Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarosa | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaína (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Ácido Bórico | Qualigens | 12005 | |
| Plástico para cultivos celulares | Corning | como aplicable | |
| Cidosina β-D-arabinofuranósido Clorhidrato Sigma | C1768-500MG | ||
| DMEM | MP BIO | ||
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Bromuro de | etidioSigma | E1510-10 mL | |
| Suero Fetal Bovino | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Kit de purificación en gel/PCR | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Ácido Acético Glacial | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plásmido | Transómico Transómico | Selección de Promotor KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| Línea celular HL60 | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Polimerasa de inicio en caliente | Merck | 71086 | |
| Línea celular Molm13 | Laboratorio Ellen Weisberg, Instituto Oncológico Dana Farber, Boston, MA, EE. UU | Instituto Oncológico Dana Farber, Boston, MA, EE. UU | |
| Línea celular MV4-11 | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicilina estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | ||
| psPAX2 y pMD2.G | Addgene | Plásmido Addgene n.º 12260 & Plásmido Addgene n.º 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library de Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Nº de lote: A116. V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus Mirus | Número de catálogo: | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra Tubos de centrífuga | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubadora | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III | clasificadora de células Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugación | Beckman Coulter | ||
| Centrífuga | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| Sistema de imágenes ChemiDoc ( Sistema Fluro Chem M) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Zeiss Axiovert 40c | |||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorómetro | Invitrogen | ||
| Termociclador | BioRad |
Referencias
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441(201....
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Reimpresiones y permisos
