약물 내성 표현형을 조절하는 인자를 식별하기 위한 풀링된 shRNA 라이브러리 스크리닝
Summary
렌티바이러스 shRNA의 풀을 이용한 고처리량 RNA 간섭(RNAi) 스크리닝은 악성종양에서 치료적으로 관련된 합성 치사적 표적을 검출하는 도구가 될 수 있다. 우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 후성 유전 학적 이펙터를 조사하기 위해 풀링 된 shRNA 스크리닝 접근법을 제공합니다.
Abstract
후천성 화학저항성의 임상적으로 관련된 동인 메커니즘을 이해하는 것은 급성 골수성 백혈병(AML) 환자의 저항성을 우회하고 생존을 향상시키는 방법을 밝히는 데 매우 중요합니다. 화학 요법에서 살아남은 백혈병 세포의 작은 부분은 화학 요법 모욕을 용인 할 수있는 후성 유전 학적 상태를 가지고 있습니다. 화학 요법에 대한 추가 노출은 이러한 약물 지속성 세포가 고정 된 후성 유전 적 상태에 도달 할 수있게하여 유전자 발현을 변경시켜 이러한 약물 내성 집단의 증식을 초래하고 결국 재발 또는 불응성 질환을 초래합니다. 따라서 약물 내성 백혈병 세포의 생존을 필요로하는 후성 유전 적 조절을 확인하는 것이 중요합니다. 우리는 획득된 시타라빈 내성 AML 세포주에서 스크리닝된 풀링된 shRNA 라이브러리를 사용하여 뉴클레오시드 유사체 시타라빈(AraC)에 대한 내성을 매개하는 후성유전학적 조절제를 확인하기 위한 프로토콜을 상세히 기술한다. 이 라이브러리는 407개의 인간 후성유전학적 인자를 표적으로 하는 5,485개의 shRNA 구축물로 구성되며, 이는 고처리량 후성유전학적 인자 스크리닝을 가능하게 한다.
Introduction
급성 골수성 백혈병 (AML)의 치료 옵션은 시타라빈 (AraC)과 안트라 사이클린이 질병 치료의 초석으로 삼아 거의 지난 XNUMX 년 동안 변하지 않았습니다. AML 요법의 성공에 대한 도전 중 하나는 백혈병 줄기 세포가 화학 요법에 저항하여 질병 재발 1,2로 이어지는 것입니다. 후성유전학적 조절은 암 발병기전과 약물 내성에 중요한 역할을 하며, 몇 가지 후성유전학적 요인들이 유망한 치료 표적으로 부상했다 3,4,5. 후성유전학적 조절 기전은 화학요법 약물에 대한 지속적인 노출하에서 증식 및 생존에 영향을 미친다. 비 혈액 학적 악성 종양에 대한 연구에 따르면 약물 효과를 극복 한 세포의 작은 부분이 다양한 후성 유전학 변형을 거쳐 그 세포의 생존 6,7을 초래한다고보고했습니다. 그러나, AML에서 시타라빈에 대한 후천적 내성을 매개하는 후성유전학적 요인의 역할은 탐구되지 않았다.
고처리량 스크리닝은 시간이 지남에 따라 전 세계적으로 중요해진 약물 발견에 대한 접근 방식이며 세포 메커니즘, 경로 프로파일 링 및 분자 수준 8,9에서 잠재적 인 표적을 식별하기위한 다양한 측면에서 표준 방법이되었습니다. 합성 치사율 개념은 두 유전자 사이의 상호작용을 포함하며, 여기서 두 유전자 중 어느 하나의 교란만이 실행 가능하지만 두 유전자의 섭동은 동시에 생존력의 상실을 초래한다(10). 암 치료에서 합성 치사율을 이용하는 것은 강력한 합성 치명적인 유전 적 상호 작용을 식별하고 기계적으로 특성화하는 데 도움이 될 수 있습니다11. 우리는 AML에서 획득 된 시타라빈 내성을 담당하는 후성 유전 적 요인을 확인하기 위해 합성 치사율로 고 처리량 shRNA 스크리닝의 조합 적 접근법을 채택했습니다.
혼합 혈통 백혈병 유전자(MLL 또는 KMT2A)의 염색체 전좌에 의해 구동되는 급성 백혈병은 환자에서 불량한 생존과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. MLL 유전자 재배열의 결과 키메라 산물, 즉 MLL 융합 단백질 (MLL-FPs)은 조혈 줄기 / 전구 세포 (HSPC)를 여러 후성 유전 적 요인의 개입으로 백혈병 폭발로 변형시킬 수 있습니다. 이러한 후성 유전 적 조절자는 백혈병 프로그램의 유지를 지시하는 복잡한 네트워크를 구성하므로 잠재적 인 치료 목표를 형성 할 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 우리는 MV4-11 세포주 (FLT3-ITD 돌연변이를 가진 MLL 융합 유전자 MLL-AF4를 보유하고; MV4-11 P로 불림)를 사용하여 MV4-11 AraC R로 불리는 획득된 시타라빈 내성 세포주를 개발하였다. 세포주는 약물 휴일로 알려진 약물 치료로부터의 간헐적 인 회복과 함께 시타라빈의 증가 된 복용량에 노출되었다. 반-최대 억제 농도(IC50)를 시험관내 세포독성 검정에 의해 평가하였다.
우리는 pZIP 렌티바이러스 백본을 갖는 hEF1a 프로모터에 의해 구동되는 풀링된 후성유전학적 shRNA 라이브러리(표 문헌 참조)를 사용하였다. 이 라이브러리는 407개의 후성유전학적 인자를 표적화하는 shRNA를 포함한다. 각 인자에는 5-24개의 shRNA가 있으며, 5개의 비표적화 대조군 shRNA를 포함하여 총 5,485개의 shRNA가 있다. 변형된 “UltrmiR” miR-30 스캐폴드는 효율적인 일차 shRNA 생물발생 및발현 12,13을 위해 최적화되었다.
이 실험의 개요는 그림 1A에 설명되어 있습니다. 현재의 프로토콜은 현탁 세포주인 MV4-11 AraC R 세포주(도 1B)에서 후성유전학적 인자 shRNA 라이브러리를 이용한 RNAi 스크리닝에 초점을 맞추고 있다. 이 프로토콜은 자신이 선택한 임의의 약물 내성 세포주에서 임의의 표적화된 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 형질도입 프로토콜은 부착성 세포에 대해 상이할 것이라는 점에 유의해야 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA 간섭 (RNAi)은 siRNA 및 shRNA 스크리닝을 포함하는 기능적 유전체학 연구에 광범위하게 사용됩니다. shRNA의 이점은 이들이 플라스미드 벡터에 혼입되어 게놈 DNA에 통합될 수 있고, 따라서 표적 mRNA의 안정한 발현 및 따라서 보다 연장된 녹다운을 초래할 수 있다는 것이다. 풀링된 shRNA 라이브러리 스크리닝은 기존의 어레이 스크린(siRNA)에 비해 견고하고 비용 효율적이다. 게놈 전체 스크린에서 특정 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 SRV에 BT / PR8742 / AGR / 36 / 773 / 2013 생명 공학부 보조금에 의해 부분적으로 자금을 지원합니다. 인도 BT/COE/34/SP13432/2015 및 인도 과학기술부: EMR/2017/003880 ~ P.B. RVS 및 P.B.는 Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 및 IA/S/15/1/501842에서 각각 지원합니다. S.D.는 CSIR-UGC 펠로우십의 지원을 받으며, S.I.는 ICMR 선임 연구 펠로우십의 지원을 받습니다. Abhirup Bagchi, Sandya Rani 및 CSCR Flow Cytometry Core Facility 직원에게 도움을 주신 것에 감사드립니다. 또한 고처리량 시퀀싱 및 데이터 분석을 도와준 MedGenome Inc.에게도 감사드립니다.
Materials
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
Referencias
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -. W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O’Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
