وصمة عار غولجي السريعة لتصور العمود الفقري الشجيري في الحصين والقشرة الجبهية
Summary
يصف البروتوكول تعديلا لطريقة Golgi السريعة ، والتي يمكن تكييفها مع أي جزء من الجهاز العصبي ، لتلطيخ الخلايا العصبية في الحصين والقشرة الجبهية الإنسية للفئران.
Abstract
يستخدم تشريب Golgi ، باستخدام مجموعة تلطيخ Golgi مع تعديلات طفيفة ، لتشريب العمود الفقري الشجيري في الحصين الفئران وقشرة الفص الجبهي الإنسية. هذه التقنية هي تحسن ملحوظ عن الطرق السابقة لتشريب غولجي لأن المواد الكيميائية المخلوطة مسبقا أكثر أمانا للاستخدام ، والخلايا العصبية مشربة بشكل جيد باستمرار ، وهناك حطام خلفية أقل بكثير ، وبالنسبة لمنطقة معينة ، هناك انحرافات صغيرة للغاية في كثافة العمود الفقري بين التجارب. علاوة على ذلك ، يمكن تجميع الأدمغة بعد نقطة معينة والاحتفاظ بها مجمدة حتى مزيد من المعالجة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن دراسة أي منطقة مثيرة للاهتمام في الدماغ. بمجرد تلطيخه وانزلاق الغطاء ، يتم تحديد كثافة العمود الفقري المتغصنة عن طريق حساب عدد العمود الفقري لطول التشعبات ويتم التعبير عنها ككثافة العمود الفقري لكل 10 ميكرومتر من التشعبات.
Introduction
تم وصف طريقة استخدام ثنائي كرومات البوتاسيوم ونترات الفضة لتسمية الخلايا العصبية لأول مرة من قبل كاميلو غولجي 1,2 واستخدمها سانتياغو رامون إي كاخال لإنتاج مجموعة هائلة من العمل الذي يميز الأنواع الفرعية العصبية والدبقية. كتاب نشر مؤخرا مع رسوماته التوضيحية متاح الآن3. بعد دراسات رامون إي كاجال ، التي نشرت منذ أكثر من 100 عام ، تم استخدام القليل جدا من تشريب غولجي. تشريب Golgi هو عملية شاقة تسمح بالتصور ثلاثي الأبعاد للخلايا العصبية باستخدام مجهر ضوئي. كانت هناك العديد من التعديلات على طريقة Golgi على مر السنين لجعل الطريقة أسهل والتلطيخ أكثر اتساقا4. في عام 1984 ، وصف Gabbott و Somogyi5 إجراء تشريب Golgi أحادي القسم الذي سمح بمعالجة أسرع. تتطلب طريقة تشريب Golgi هذه تروية بنسبة 4٪ من بارافورمالديهايد و 1.5٪ من حمض البيكريك ، بعد التثبيت تليها تقسيم الاهتزاز إلى حمام من 3٪ ثنائي كرومات البوتاسيوم. يتم تثبيت الأقسام على شرائح زجاجية ، ويتم لصق الزوايا الأربع للأغطية بحيث يكون الانتشار تدريجيا عند غمرها في نترات الفضة. ثم تنبثق الأغطية ، وتجف الأقسام ، وفي النهاية ينزلق الغطاء بشكل دائم مع وسط التركيب. تم استخدام هذه التقنية بنجاح لتسمية الخلايا العصبية والدبقية 6,7,8 في الحصين. طريقة Golgi السريعة الموصوفة هنا هي تحسن لأن هناك تعرضا أقل بكثير لكل من ثنائي كرومات البوتاسيوم ونترات الفضة ولا يتم استخدام بارافورمالديهايد وحمض البيريكريك. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أنه يمكن تحليل الخلايا التي تم تشريبها باستخدام تعديلات طريقة Gabbott و Somogyi5 ، إلا أنه غالبا ما كانت الأقسام معرضة بشكل مفرط أو ناقص أو سقطت من الشرائح أثناء خطوة الجفاف وبشكل عام ، كان لا بد من تجميع العديد من التجارب للحصول على خلايا كافية للتحليل.
يصف هذا البروتوكول استخدام مجموعة تلطيخ غولجي (انظر جدول المواد) لوضع علامات على التشعبات والعمود الفقري التنغيري في الحصين والقشرة الفموية الإنسية (mPFC) للفئران. مزايا هذه الطريقة على الطرق السابقة هي أنها سريعة ، وهناك تعرض أقل للمواد الكيميائية الضارة للباحث وهناك تلطيخ ثابت للخلايا العصبية. تم استخدام البروتوكول الموصوف أدناه مع تعديلات طفيفة لتقييم كثافة العمود الفقري الشجيري في الحصين و mPFC للفئران في العديد من الدراسات9،10،11،12،13،14،15.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة تشريب غولجي التي تسمح بالمعالجة السريعة المتزامنة للعديد من الأقسام. إنه تحسن على5 طرق أخرى كثيفة العمالة موصوفة سابقا وينتج باستمرار خلايا عصبية مشربة للتحليل. بالإضافة إلى ذلك ، هناك تعرض أقل للمواد الكيميائية السامة المستخدمة في تشريب غولجي. الجز?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مبادرة أبحاث جامعة القلب المقدس الجامعيةGrants.
Materials
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
Referencias
- Pannese, E. The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).
- Bentivoglio, M., et al. The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3 (2019).
- Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. . The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal. , 208 (2017).
- Dall’Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. The "single-section" Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The ‘single’ section Golgi-impregnation procedure: methodological description. Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone. Glia. 3 (4), 283-292 (1990).
- Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).
- Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).
- Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat. Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).
- Frankfurt, M., Luine, V. The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol. Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).
- Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age. Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).
- Bowman, R. E., et al. Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats. Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).
- Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats. Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).
- Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines. Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).
- Jacome, L. F., et al. Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats. Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).
- Frankfurt, M. Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory. Research Features. , (2021).
- Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex. Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).
- Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats. Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).
- Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood. Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).
- Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density. Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).
- Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia. Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).
- Zemmar, A., et al. Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex. Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).
