غشاء السمان Chorioallantoic - أداة للتشخيص الضوئي الديناميكي والعلاج
Summary
الغشاء المشيمي (CAM) لجنين الطيور هو أداة مفيدة للغاية وقابلة للتطبيق لمختلف مجالات البحث. نموذج خاص من البيضاوي السابق من السمان الياباني CAM مناسب للتحقيق في العلاج الضوئي الديناميكي.
Abstract
الغشاء المشيمي (CAM) لجنين الطيور هو غشاء رقيق خارج الجنين يعمل كعضو تنفسي أساسي. خصائصه تجعله نموذجا تجريبيا ممتازا في الجسم الحي لدراسة تكوين الأوعية الدموية ، ونمو الورم ، وأنظمة توصيل الأدوية ، أو التشخيص الضوئي الديناميكي (PDD) والعلاج الضوئي الديناميكي (PDT). وفي الوقت نفسه، يتناول هذا النموذج شرط استبدال التجارب ببديل مناسب. يسمح الجنين المزروع ب Ex ovo بسهولة تطبيق المادة والوصول إليها ومراقبتها وتوثيقها. الأكثر استخداما هو CAM الفرخ. ومع ذلك ، تصف هذه المقالة مزايا CAM السمان الياباني كنموذج منخفض التكلفة وعالي الإنتاجية. ميزة أخرى هي التطور الجنيني الأقصر ، والذي يسمح بدوران تجريبي أعلى. يتم استكشاف مدى ملاءمة CAM السمان ل PDD و PDT للسرطان والالتهابات الميكروبية هنا. على سبيل المثال ، يتم وصف استخدام المحسس الضوئي hypericin مع البروتينات الدهنية أو الجسيمات النانوية كنظام توصيل. تم تحديد درجة الضرر من الصور في الضوء الأبيض والتغيرات في شدة التألق لأنسجة CAM تحت الضوء البنفسجي (405 نانومتر) ، جنبا إلى جنب مع تحليل المقاطع النسيجية. أظهر CAM السمان بوضوح تأثير PDT على الأوعية الدموية والأنسجة. علاوة على ذلك ، يمكن ملاحظة تغييرات مثل النزيف الشعري ، والجلطة ، وتحلل الأوعية الصغيرة ، ونزيف الأوعية الكبيرة. يعد CAM للسمان الياباني نموذجا واعدا في الجسم الحي للتشخيص الضوئي الديناميكي وأبحاث العلاج ، مع تطبيقات في دراسات تكوين الأوعية الدموية للورم ، وكذلك العلاج المضاد للأوعية الدموية ومضادات الميكروبات.
Introduction
نموذج غشاء الدجاج chorioallantoic (CAM) معروف جيدا ويستخدم على نطاق واسع في مختلف مجالات البحث. وهو عضو خارج الجنين غني بالأوعية الدموية يوفر تبادل الغازات ونقل المعادن1. نظرا لشفافية هذا الغشاء وإمكانية الوصول إليه ، يمكن ملاحظة الأوعية الدموية الفردية وتغييراتها الهيكلية في الوقت الفعلي2. على الرغم من المزايا ، فإن CAM الفرخ لديه أيضا بعض القيود (على سبيل المثال ، مرافق تربية أكبر ، وإنتاج البيض ، واستهلاك الأعلاف) التي يمكن تجنبها باستخدام أنواع الطيور الأخرى. في هذا البروتوكول ، يتم وصف نموذج CAM بديل ل ex ovo باستخدام جنين السمان الياباني (Coturnix japonica). نظرا لصغر حجمه ، فإنه يسمح باستخدام عدد أكبر بكثير من الأفراد التجريبيين من CAM الدجاج. علاوة على ذلك ، فإن التطور الجنيني الأقصر لمدة 16 يوما لأجنة السمان هو ميزة أخرى. تظهر أول أوعية أكبر على CAM السمان في اليوم الجنيني (ED) 7. يمكن مقارنة ذلك مباشرة مع تطور جنين الفرخ (المراحل 4-35) ؛ ومع ذلك ، فإن المراحل المتأخرة من التطور لم تعد قابلة للمقارنة وتتطلب وقتا أقل لجنين السمان3. من المثير للاهتمام هو الحدوث المنتظم للتفرع الوعائي الدقيق على غرار الدجاج CAMs 4,5,6. النضج الجنسي السريع ، وارتفاع إنتاج البيض ، والتربية منخفضة التكلفة هي أمثلة أخرى تفضل استخدام هذا النموذج التجريبي7.
غالبا ما يستخدم نموذج CAM للطيور في دراسات العلاج الضوئي الديناميكي (PDT)8. يستخدم PDT لعلاج عدة أشكال من السرطان (الأورام الموضعية الصغيرة) وغيرها من الأمراض غير الورمية. مبدأها هو في توصيل دواء الفلورسنت ، وهو محسس للضوء (PS) ، إلى الأنسجة التالفة وتنشيطه بضوء الطول الموجي المناسب. أحد PS المحتملين المستخدمين في الأبحاث هو hypericin ، المعزول أصلا من نبتة سانت جون الطبية (Hypericum perforatum)9. تعتمد تأثيرات الحساسية الضوئية القوية لهذا المركب على خصائصه الكيميائية الضوئية والفيزيائية الضوئية. تتميز هذه بقمم إثارة التألق المتعددة في نطاق 400-600 نانومتر ، مما يحفز انبعاث التألق عند حوالي 600 نانومتر. الحد الأقصى لامتصاص hypericin داخل النطاق الطيفي هو في نطاق 540-590 نانومتر ، والحد الأقصى للتألق في نطاق 590-640 نانومتر9. لتحقيق هذه التأثيرات الحساسة للضوء ، يتم إثارة hypericin بواسطة ضوء الليزر بطول موجي يبلغ 405 نانومتر بعد الإدارة المحلية10. في وجود الضوء ، يمكن أن يظهر hypericin تأثيرات مبيد للفيروسات ومضاد للتكاثر وسام للخلايا11 ، في حين لا توجد سمية جهازية ، ويتم إطلاقه بسرعة من الكائن الحي. Hypericin هي مادة محبة للدهون تشكل مجاميع غير قابلة للذوبان في الماء وغير فلورية ، وهذا هو السبب في أن عدة أنواع من الناقلات النانوية ، مثل الجسيمات النانوية البوليمرية12,13 أو البروتينات الدهنية عالية ومنخفضة الكثافة (HDL ، LDL) 14,15 ، تستخدم للمساعدة في توصيلها واختراقها في الخلايا. نظرا لأن CAM هو نظام يعاني من نقص المناعة بشكل طبيعي ، يمكن زرع الخلايا السرطانية مباشرة على سطح الغشاء. كما أن النموذج مناسب تماما لتسجيل مدى تلف الأوعية الدموية الناجم عن PDT وفقا لدرجة محددة16,17. يمكن استخدام ضوء أقل كثافة مقارنة ب PDT للتشخيص الضوئي الديناميكي (PDD). تؤدي مراقبة الأنسجة تحت ضوء LED البنفسجي المثير أيضا إلى التنشيط الضوئي للمحسسات الضوئية18،19،20 التي تؤدي إلى انبعاث ضوء الفلورسنت ، ومع ذلك فهي لا توفر طاقة كافية لبدء تفاعل PDT وإتلاف الخلايا. إنه يجعلها أداة جيدة لتصور الورم وتشخيصه أو مراقبة الحرائك الدوائية ل PSs14,15 المستخدمة.
توضح هذه المقالة إعداد فحص CAM للسمان ex ovo مع معدلات البقاء على قيد الحياة أكثر من 80٪. تم تطبيق هذه الثقافة السابقة بنجاح في عدد كبير من التجارب.
Protocol
Representative Results
Discussion
لنجاح زراعة البيضة السابقة ، من المهم اتباع البروتوكول أعلاه. علاوة على ذلك ، إذا لم يتم فتح البيض بعناية كافية أو لم تكن هناك رطوبة كافية أثناء الزراعة ، فإن كيس صفار البيض يلتصق بالقشرة وغالبا ما يتمزق. إن بدء زراعة البيضة السابقة في وقت حوالي 60 ساعة من حضانة البيض يضمن ارتفاع مع…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل من قبل VEGA 2/0042/21 و APVV 20-0129. مساهمة V. Huntošová هي نتيجة لتنفيذ المشروع: مجتمع علمي مفتوح للبحوث الحديثة متعددة التخصصات في الطب (اختصار: OPENMED) ، ITMS2014 +: 313011V455 بدعم من البرنامج التشغيلي للبنية التحتية المتكاملة ، بتمويل من ERDF.
Materials
| 6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
| CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
| digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
| diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
| eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubator Bios Midi | Bios Sedl any, Czech Republic |
Forced draught incubator for initial incubation | |
| incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
| Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
| LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
| macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
| microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
| microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
| scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
| software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
| stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
| stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
Referencias
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation. Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3 (2010).
- De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).
- Sandau, K., Kurz, H. Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis. Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).
- Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application. Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).
- Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model. Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).
- Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).
- Miškovský, P. Hypericin – a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules. Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).
- Čavarga, I., et al. Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model. Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).
- Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).
- Datta, S., et al. Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery. Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).
- Huntošová, V., et al. Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin. Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).
- Buríková, M., et al. Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery. General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).
- Lenkavska, L., et al. Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).
- Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).
- Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).
- Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. Journal of the National Cancer Institute. 90, 889-905 (1998).
- Xiang, L., et al. Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model. Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).
- Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials. ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).
- Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).
- Merlos Rodrigo, M. A., et al. Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells. Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).
- Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica). Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).
- Kohli, N., et al. Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications. Biology-Basel. 10 (4), 301 (2021).
- Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).
- Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).
