Desenvolvimento de organoides da Pituitária do Rato como Modelo In Vitro para Explorar a Biologia das Células-Tronco Pituitárias
Summary
A glândula pituitária é o principal regulador do sistema endócrino do corpo. Este artigo descreve o desenvolvimento de organoides da pituitária do camundongo como um novo modelo in vitro 3D para estudar a população de células-tronco da glândula da qual a biologia e a função permanecem mal compreendidas.
Abstract
A pituitária é a glândula endócrina mestre que regula os principais processos fisiológicos, incluindo crescimento corporal, metabolismo, maturação sexual, reprodução e resposta ao estresse. Há mais de uma década, células-tronco foram identificadas na glândula pituitária. No entanto, apesar da aplicação de abordagens in vivo transgênicas, seu fenótipo, biologia e papel permanecem incertos. Para enfrentar esse enigma, um novo e inovador modelo in vitro organoide é desenvolvido para desvendar profundamente a biologia das células-tronco pituitárias. Os organoides representam estruturas celulares 3D que, sob condições culturais definidas, se auto-desenvolvem a partir das células-tronco (epiteliais) de um tecido e recapitulam múltiplas marcas dessas células-tronco e seu tecido. É mostrado aqui que organoides derivados da hipófise do rato desenvolvem-se a partir das células-tronco da glândula e recapitulam fielmente suas características fenotípicas e funcionais in vivo . Entre outros, reproduzem o estado de ativação das células-tronco como in vivo ocorrendo em resposta a danos locais transgenicamente infligidos. Os organoides são expansíveis a longo prazo, mantendo robustamente seu fenótipo de caule. O novo modelo de pesquisa é altamente valioso para decifrar o fenótipo e o comportamento das células-tronco durante as condições-chave da remodelação pituitária, que vão desde a maturação neonatal até o desbotamento associado ao envelhecimento e de glândulas saudáveis a doentes. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para estabelecer organoides derivados da pituitária do rato, que fornecem uma poderosa ferramenta para mergulhar no mundo ainda enigmático das células-tronco pituitárias.
Introduction
A pituitária é uma pequena glândula endócrina localizada na base do cérebro, onde está conectada ao hipotálamo. A glândula integra insumos periféricos e centrais (hipotalâmicos) para gerar uma liberação hormonal afinada e coordenada, regulando assim órgãos endócrinos de alvo a jusante (como glândulas suprarrenais e gônados) para produzir hormônios apropriados no momento adequado. A pituitária é o principal regulador do sistema endócrino e, portanto, é legitimamente denominada a glândula mestre1.
A pituitária do rato é composta por três lóbulos (Figura 1), ou seja, o lobo anterior (AL), o lobo intermediário (IL) e o lobo posterior (PL). A al endócrina principal contém cinco tipos de células hormonais, incluindo somatotropes que produzem hormônio do crescimento (GH); lactotropas gerando prolactina (PRL); corticotrópicas que secretam hormônio adrenocorticotrópico (ACTH); thyrotropes responsáveis pela produção de hormônio estimulante da tireoide (TSH); e gonadotropes que fazem hormônio luteinizador (LH) e hormônio estimulante do folículo (FSH). O PL consiste em projeções axonais do hipotálamo em que os hormônios ocitocina e vasopressina (hormônio antidiurético) são armazenados. O IL está localizado entre a AL e o PL e abriga melanantropos que produzem hormônio estimulante de melanócitos (MSH). Na pituitária humana, o IL regrede durante o desenvolvimento, e os melanotropos são espalhados dentro da AL1. Além das células endócrinas, a glândula pituitária também contém um conjunto de células-tronco, essencialmente marcadas pelo fator de transcrição SOX2 2,3,4,5,6. Estas células SOX2+ estão localizadas na zona marginal (MZ), o revestimento epitelial da fissura (um lúmen remanescente embrionário entre a AL e a IL), ou são espalhadas como aglomerados por todo o parenchyma da AL, propondo assim dois nichos de células-tronco na glândula (Figura 1)2,3,4,5,6.
Dada a natureza indispensável da hipófise, o mau funcionamento da glândula está associado à morbidade grave. O hiperpituitarismo (caracterizado pela supernecreção de um ou mais hormônios) e hipopituitarismo (produção defeituosa ou ausente de um ou mais hormônios) podem ser causados por tumores neuroendócrinos pituitários (PitNETs; por exemplo, tumores produtores de ACTH que levam à doença de Cushing) ou por defeitos genéticos (por exemplo, deficiência de GH resultando em nanô)7. Além disso, cirurgia pituitária (por exemplo, para remover tumores), infecções (por exemplo, tuberculose hipotalâmica-pituitária, ou infecções após meningite bacteriana ou encefalite), síndrome de Sheehan (necrose devido ao fluxo sanguíneo insuficiente devido à forte perda de sangue ao nascer), apoplexia pituitária e lesão cerebral traumática são outras causas importantes de hipofunção pituitária8 . Foi demonstrado que a pituitária do camundongo possui a capacidade regenerativa, sendo capaz de reparar danos locais introduzidos pela ablação transgênica das células endócrinas 9,10. As células-tronco SOX2+ reagem agudamente à lesão infligida mostrando um fenótipo ativado, marcado por maior proliferação (resultando em expansão de células-tronco) e aumento da expressão de fatores e caminhos relacionados à haste (por exemplo, WNT/NOTCH). Além disso, as células-tronco começam a expressar o hormônio ablado, resultando finalmente na restauração substancial da população celular empobrecida ao longo dos seguintes (5 a 6) meses 9,10. Além disso, durante a fase de maturação neonatal da glândula (as primeiras 3 semanas após o nascimento), as células-tronco pituitárias estão prosperando em um estado ativado 6,11,12,13, enquanto o envelhecimento organismo está associado à diminuição da funcionalidade de células-tronco in situ, devido a um ambiente inflamatório crescente (micro-) ao envelhecimento (ou ‘inflamação’)10,14 . Além disso, a tumorigênese na glândula também está associada à ativaçãode células-tronco 7,15. Embora a ativação de células-tronco tenha sido detectada em várias situações de remodelação pituitária (revisada em 7,16), os mecanismos subjacentes permanecem incertos. Uma vez que as abordagens in vivo (como o rastreamento de linhagem em camundongos transgênicos) não forneceram uma imagem clara ou abrangente de células-tronco pituitárias, o desenvolvimento de modelos in vitro confiáveis para explorar a biologia de células-tronco em hipófise normal e doente é essencial. A cultura in vitro padrão de células-tronco primárias pituitárias permanece inadequada devido à capacidade de crescimento muito limitada e condições não fisiológicas (2D) com perda rápida de fenótipo (para uma visão geral mais detalhada, veja16). Culturas de esfera 3D (pituosferas) foram estabelecidas a partir de células-tronco pituitárias identificadas pela população lateral e fenótipo SOX2+ 2,3,4. As pituferas crescem clonalmente a partir das células-tronco, expressam marcadores de tronco e mostram capacidade de diferenciação nos tipos de células endócrinas. No entanto, eles não se expandem consideravelmente, mostrando apenas passabilidade limitada (2-3 passagens)3,4. Estruturas semelhantes a esferas também foram obtidas de aglomerados de células-tronco pituitárias não dissociados quando cultivadas em Matrigel 50% diluído por 1 semana, mas a expansão não foi mostrada17. A abordagem pituisphere é usada principalmente como uma ferramenta de leitura para números de células-tronco, mas outras aplicações são limitadas por capacidade de expansão inferior16.
Para resolver e superar essas deficiências, um novo modelo 3D foi recentemente estabelecido, ou seja, organoides, a partir da maior AL endócrina de camundongos contendo as células-tronco MZ e parenchymal. Foi demonstrado que os organoides são de fato derivados das células-tronco da hipófise e recapitulam fielmente seu fenótipo18. Além disso, os organoides são expansíveis a longo prazo, mantendo robustamente sua natureza de caule. Portanto, eles fornecem um método confiável para expandir células-tronco primárias pituitárias para exploração profunda. Tal exploração não é alcançável com o número limitado de células-tronco que podem ser isoladas de uma pituitária, que também não são expansíveis em condições 2D16. Foi demonstrado que os organoides são ferramentas valiosas e confiáveis para descobrir novas características de células-tronco pituitárias (traduzíveis para in vivo)14,18. É importante ressaltar que o modelo organoide espelha fielmente o estado de ativação de células-tronco pituitárias como ocorrendo durante danos teciduais locais e maturação neonatal, mostrando maior eficiência de formação e replicando vias moleculares regulamentadas14,18. Assim, o modelo organoide derivado da hipófise é um inovador e poderoso modelo de pesquisa de biologia de células-tronco pituitárias, bem como uma ferramenta de leitura de ativação de células-tronco.
Este protocolo descreve em detalhes o estabelecimento de organoides derivados da pituitária do rato. Para este objetivo, a AL é isolada e dissociada em células únicas, que são incorporadas em matrigel extracelular (aquion referido como ECM). O conjunto célula-ECM é então cultivado em um meio definido, essencialmente contendo fatores de crescimento de células-tronco e reguladores embrionários pituitários (ainda mais chamados de “meio organoide pituitário” (PitOM)18; Tabela 1). Uma vez que os organoides são totalmente desenvolvidos (após 10-14 dias), eles podem ser ainda mais expandidos através de passagem sequencial e submetidos a extensa exploração a jusante (por exemplo, imunofluorescência, RT-qPCR e transcrição em massa ou unicelular; Figura 1). A longo prazo, espera-se que os organoides de células-tronco pituitárias abram caminho para abordagens de reparação tecidual e medicina regenerativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os organoides derivados da AL, como descrito aqui, representam um poderoso modelo de pesquisa para estudar células-tronco pituitárias in vitro. Atualmente, essa abordagem organoide é a única ferramenta disponível para crescer e expandir as células-tronco primárias. Um modelo organoide pituitário derivado de células-tronco embrionárias (ESC) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) foi relatado anteriormente, o que recapitula de perto a organogênese embrionária pituitária2…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios do Ku Leuven Research Fund e do Fundo de Pesquisa Científica (FWO) – Flandres. E.L. (11A3320N) e C.N. (1S14218N) são apoiados por uma Bolsa de Doutorado da FWO/FWO-SB.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491023 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G | BD Plastipak | BDAM303176 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
Referencias
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