DNAファイバーアッセイを用いたヒト細胞における複製後ギャップの蓄積と修復の検出
Summary
ここでは、病変誘導後のDNA複製における一本鎖DNAギャップを調べるためのDNAファイバーアッセイの2つの改変について説明する。S1ファイバーアッセイは、ssDNA特異的S1エンドヌクレアーゼを使用して複製後ギャップの検出を可能にし、ギャップ充填アッセイはギャップ修復の視覚化および定量を可能にする。
Abstract
DNAファイバーアッセイは、ヒト細胞におけるDNA合成中に組み込まれるヌクレオチド類似体の免疫検出に基づいて、複製フォークダイナミクスを分析するための簡単で堅牢な方法です。しかし、この手法の分解能は数千キロベースに制限されています。その結果、複製後の一本鎖DNA(ssDNA)ギャップは数百塩基ほど小さく、標準的なアッセイでは検出できません。ここでは、ssDNAを特異的に切断する酵素であるS1ヌクレアーゼを利用するDNAファイバーアッセイの改変版について説明する。複製後のssDNAギャップの存在下で、S1ヌクレアーゼはギャップを標的にして切断し、進行中のフォーク上のssDNAギャップの読み出しとして使用できるより短いトラクトを生成する。これらの複製後のssDNAギャップは、損傷したDNAが不連続に複製されるときに形成される。それらは、ゲノム複製から結合されていないメカニズム を介して 、ギャップ充填または複製後修復として知られるプロセスで修復することができる。ギャップ充填機構はS相とは無関係にDNA合成を伴うため、DNAファイバー標識スキームの変化を利用してギャップ充填事象を監視することもできます。全体として、DNAファイバーアッセイのこれらの改変は、複製後のギャップがヒト細胞のゲノムにどのように形成され、埋められるかを理解するための強力な戦略です。
Introduction
精液研究は、細菌1およびヒト細胞2,3におけるDNA損傷剤による処理時に、複製後一本鎖(ssDNA)ギャップの蓄積の証拠を提供している。損傷したDNAテンプレートの複製中、DNA合成機構は、特異的な病変転移合成DNAポリメラーゼを採用することによって、またはテンプレート切り替え機構を介して病変をバイパスすることができる。あるいは、レプリソームはまた、ssDNAギャップを残して病変を単にスキップし、後で修復することもできる。より最近では、遺伝毒性物質による治療が、電子顕微鏡法を利用して複製中間体の特異的構造を可視化することによって、真核生物のssDNAギャップをもたらすことが明らかに示された研究4。複製後ギャップのこれらの領域の形成は、DNA複製の半不連続モードの単純な結果であると最初に提案された2。この場合、遅れ鎖上の病変は岡崎断片の伸長を遮ることができるが、フォークの進行は次の岡崎断片によって自然に救助され、ssDNAギャップが残る。しかし、さらなる研究は、細菌5で最初に示されたように、先行鎖上のギャップの形成も可能であることを実証した。真核生物において、プリマーゼ活性を有するユニークなDNAポリメラーゼであるPRIMPOLは、そのリプライミング活性を介して複製遮断病変の下流でDNA合成を再開できることが示された6、7、8、9、10、11。したがって、PRIMPOL primase活性は、ヒト細胞12においてDNA損傷剤で処理した際の先行鎖における複製後ssDNAギャップの形成を説明し得る。それにもかかわらず、これらのギャップの検出ならびにギャップ修復は、最近まで、電子顕微鏡4またはプラスミドベースのアッセイ13などの間接的または時間のかかるアプローチを必要とした。ヒト細胞のギャップを検出するためのssDNA特異的S1ヌクレアーゼの使用は、スクロース勾配技術を用いた40年以上前の初期の研究によって開拓された2,3。より最近では、我々のグループは、DNAファイバーアッセイや彗星アッセイなどの他の方法を用いて、DNAを複製する際のssDNAを検出するために、このヌクレアーゼの使用を適用した14。これらの新しいアプローチは、複製後のギャップに関する研究の現在の急増への道を開いた。ここでは、S1ヌクレアーゼを使用してDNAファイバーアッセイによる複製後のssDNAギャップを検出する戦略を説明し、DNAファイバープロトコルの差動標識スキームがこれらのギャップの修復の研究をどのように可能にできるかを説明する。
DNAファイバーアッセイは、ますます多くのラボで使用されている強力な技術であり、レプリケーションフォークダイナミクスとレプリケーションストレス応答メカニズムに関する貴重な洞察を提供してきました。簡単に述べると、この技術は、ヌクレオチド類似体(CldU−5−クロロ−2’−デオキシウリジン−、およびIdU−5−ヨード−2’−デオキシウリジンなど)の複製DNAへの逐次的な組み込みに基づいている。回収後、細胞を溶解し、DNA分子を正にコーティングしたスライドガラス上に広げる。その後、CldUおよびIdUは特異的抗体によって検出され、蛍光顕微鏡で二色繊維として可視化することができる。最後に、IdU および CldU 管の長さを測定して、DNA 損傷誘導の結果としての DNA 複製ダイナミクスの変化を同定します。この技術は、フォーク失速、フォーク減速、新生DNA分解、および起源発火の頻度の変動などの異なる現象を調査するために利用することができる15,16。
DNAファイバーアッセイの限界の1つは、数キロ塩基の分解能です。複製後のssDNAギャップは数百塩基の範囲にある可能性があるため、標準的なDNAファイバープロトコルによってこれらのギャップを直接視覚化することは不可能です。遺伝毒性物質で処理されたヒト細胞における複製DNA上のssDNAギャップの存在は、以前に間接的に関与していた。例えば、ssDNA結合タンパク質のリクルートによって評価されるssDNAの観察は、複製プロテインA(RPA)、S期外の細胞において、またはアルカリDNA解舒によって検出されるようなssDNAの形成と、DNAファイバーアッセイによる長時間のフォークストールの不在との組み合わせ12、17、18、19、20、21 ssDNAギャップの蓄積に起因するものであった。さらに、複製後のssDNAギャップは、ATR依存性のG2/M期チェックポイントを誘導し、複製毒18、19、20、21、22で処理された細胞を逮捕する。
S1ヌクレアーゼは、5′-ホスホリルモノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを放出する一本鎖核酸を分解し、RNAと比較してssDNAに対して5倍高い親和性を有する。二本鎖核酸(DNA:DNA、DNA:RNA、またはRNA:RNA)は、極端に高濃度で使用される場合を除き、S1ヌクレアーゼに対して耐性を有する。S1ヌクレアーゼはまた、ニック、ギャップ、ミスマッチ、またはループによって引き起こされる一本鎖領域で二本鎖DNAを切断する。したがって、S1ヌクレアーゼは、ssDNAギャップを切断することができるssDNA特異的エンドヌクレアーゼであり、最終的に二本鎖切断23、24を生成する。したがって、S1ヌクレアーゼ消化のためのステップをDNAファイバープロトコルに間接的に追加することにより、複製後のssDNAギャップの検出が可能になる。ギャップの存在下では、DNA拡散の前にS1ヌクレアーゼで露出した核を処理すると、ギャップ14に本質的に存在するssDNAのS1切断の結果として、より短いトラクトが生成されます。したがって、トラクト短縮は、このアプローチを用いたssDNAギャップの読み出しである。標準的なDNAファイバープロトコルと比較して、S1ヌクレアーゼを用いたDNAファイバーは、核曝露(細胞透過処理)およびS1ヌクレアーゼによる処理の2つの余分なステップしか必要としない。遺伝毒性物質で処理したがS1ヌクレアーゼを含まないサンプルや、遺伝毒性物質を含まないS1ヌクレアーゼで処理したサンプルなど、適切なコントロールが必須であることに注意することが重要です。類似体の組み込み、S1処理、および拡散を含むプロトコル自体は、1日で実行することができ、例外的な材料を必要としない。必要なのは、チミジン類似体、精製S1ヌクレアーゼ、適切な一次抗体および二次抗体、および蛍光顕微鏡のみです。全体として、S1ヌクレアーゼを採用したDNAファイバーは、比較的単純なアプローチを使用して、進行中の複製フォーク上のssDNAギャップを検出する。
複製ストレス応答機構の結果として形成された複製後ssDNAギャップは、ギャップ充填または複製後修復(PRR)25と呼ばれるプロセスにおいて、病変転移DNA合成またはテンプレートスイッチングを含む異なる機構によって修復(または充填)され得る25。これらのプロセスは、進行するフォークの後ろで起こり、複製に依存しないDNA合成を伴う14,26,27。これらの知見に基づいて、標準的なDNAファイバーアッセイとは異なる標識スキームを実行して、G2相におけるギャップ充填事象を直接視覚化することができる14、16、26、28。具体的には、1つのチミジン類似体は、遺伝毒性治療および複製後のssDNAギャップ形成時に複製フォークを標識するために使用でき、一方、別のチミジン類似体は、ギャップ充填事象を標識するために使用することができる。このプロトコールでは、細胞は、1時間の遺伝毒性処理の直後またはそれと同時に、第1のチミジン類似体(例えばIdU)で標識され、その結果、新生DNAはギャップ形成時に標識される。ノコダゾールは、G2 / Mの細胞を停止させるために12〜24時間の間の任意の場所で治療時に添加され、以下のS期を防止する。ノコダゾール処理の最後の4時間のために、第2のチミジン類似体(例えばCldU)を、ギャップ充填中に組み込まれる媒体に添加する。重要なことに、このアッセイは、CldUからのギャップ充填シグナルがS期の複製DNAへのCldUの取り込みによるシグナルと区別できないため、G2のギャップ充填事象を検出するためにのみ使用することができる。したがって、バックグラウンドシグナルを最小限に抑えるために、損傷誘導後のCldU取り込みのタイミングは、細胞集団の大部分がG2期14に入っているときと一致するべきである。したがって、このタイミングは、細胞株および処理条件によって異なるであろう。このアッセイを採用する前に細胞周期の進行を最適化することが推奨される。これらのチミジン類似体の共染色により、ssDNAギャップが生成されたときに遺伝毒性処理中に合成された新生DNA(IdUトラクト)の上にギャップ充填(PRR)トラクト(CldUパッチ)を可視化することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
標準的なDNAファイバーアッセイプロトコルの重要なステップは、以前の刊行物32で議論された。ここでは、複製後のssDNAギャップの存在とギャップ充填によるそれらの修復を調査するための標準的なDNAファイバーアッセイの改変バージョンについて述べる(14で最初に記載)。複製後のssDNAギャップ存在の文脈において、S1ファイバープロトコルにおけるS1ヌク?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.F.M.M.研究所での研究は、FAPESPとオランダ科学研究機構(NWO、オランダ)の国際共同研究の下で、サンパウロ財団(ブラジル、サンパウロ、FAPESP、助成金#2019/19435-3、#2013/08028-1、2017/05680-0)の支援を受けています。Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] および Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Finance Code 001).
Materials
| Acetic acid, Glacial | Synth | 64-19-7 | Alternatively, BSA – Biosera – REF PM-T1725/100 |
| Ammonium hydroxide | Synth | 1336-21-6 | Or similar |
| Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | – |
| Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470 | – |
| Antibody Mouse anti-BrdU | Becton Disckson | 347580 | – |
| Antibody Rat anti-BrdU | Abcam | Ab6326 | – |
| Biological security hood | Pachane | PA 410 | Use hood present in the laboratory |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | Or similar |
| Cell scraper | Thermo Scientific | 179693 | Or similar |
| CldU | Millipore-Sigma | C6891 | – |
| Cloridric acid | Synth | 7647-01-0 | Or similar |
| Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) | Zeiss | – | Or similar |
| Cover glass (or coverslips) | Thermo Scientific | 152460 | Alternatively, Olen – Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) – K5-2460 |
| DMEM – High Glucose | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | Use culture media specific for the cell line used. |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | E5314 | Or similar |
| Epifluorescence Microscope Axiovert 200 | Zeiss | – | Or similar |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 12657-029 | Or similar |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | Use cell incubator present in the laboratory |
| Glass slide jar | Sigma-Aldrich | S5516 | Or similar |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | Or similar |
| Idu | Millipore-Sigma | I7125 | – |
| Magnesium Chloride | Synth | 7791-18-6 | Or similar |
| Methanol | Merck | 67-56-1 | Or similar |
| Microscope slides | Denville | M1021 | Alternatively, Olen – Kasvi Microscope Slides – K5-7105 OR Precision Glass Line – 7105-1 |
| MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) | Synth | 1132-61-2 | Or similar |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9 | – |
| PBS (Phosphate Buffer Saline) | Life Thechnologies | 3002 | Or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Or similar |
| ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used |
| S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 – 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | BioRad | 161-0302 | Or similar |
| Sodium Acetate Trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | Or similar |
| Sodium Chloride | Synth | 7647-14-5 | Or similar |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | Or similar |
| Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | Or similar |
| Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | Or similar |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Or similar |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Or similar |
| UVC Lamp | Non Specific | – | Essential: emission lenght of 254 nm |
| VLX-3W UV Radiometer | Vilber Loumart | – | Or similar |
| Zinc Acetate | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Or similar |
Referencias
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