זיהוי של פערים לאחר שכפול הצטברות ותיקון בתאים אנושיים באמצעות בדיקת סיבי DNA
Summary
כאן אנו מתארים שני שינויים של בדיקת סיבי הדנ”א כדי לחקור פערי דנ”א חד-גדיליים בשכפול דנ”א לאחר אינדוקציה של נגע. בדיקת הסיבים S1 מאפשרת זיהוי של פערים לאחר שכפול באמצעות אנדונוקלאז S1 ספציפי ל-SSDNA, בעוד שבדיקת מילוי הפער מאפשרת הדמיה וכימות של תיקון פערים.
Abstract
בדיקת סיבי הדנ”א היא שיטה פשוטה וחזקה לניתוח דינמיקה של מזלג שכפול, המבוססת על אימונו-דטקציה של אנלוגים נוקלאוטידים המשולבים במהלך סינתזת דנ”א בתאים אנושיים. עם זאת, טכניקה זו יש רזולוציה מוגבלת של כמה אלפי קילובסיסים. כתוצאה מכך, פערי דנ”א חד-גדילי (ssDNA) לאחר שכפול, קטנים עד כמה מאות בסיסים, אינם ניתנים לזיהוי על ידי הבדיקה הסטנדרטית. כאן אנו מתארים גרסה שונה של בדיקת סיבי הדנ”א המשתמשת בנוקלאז S1, אנזים שמבקע באופן ספציפי את ה-ssDNA. בנוכחות פערי ssDNA לאחר שכפול, הנוקלאז S1 יתמקד במרווחים ויבקע אותם, ויצר דרכים קצרות יותר שיכולות לשמש כקריאה לרווחי ssDNA על מזלגות מתמשכים. פערי ssDNA אלה לאחר שכפול נוצרים כאשר דנ”א פגום משוכפל ללא הרף. ניתן לתקן אותם באמצעות מנגנונים שאינם מחוברים לשכפול הגנום, בתהליך המכונה מילוי פערים או תיקון לאחר שכפול. מאחר שמנגנוני מילוי פערים כוללים סינתזת דנ”א שאינה תלויה בשלב S, ניתן להשתמש בשינויים בסכמת תיוג סיבי הדנ”א גם כדי לעקוב אחר אירועים של מילוי פערים. בסך הכל, שינויים אלה של בדיקת סיבי הדנ”א הם אסטרטגיות רבות עוצמה כדי להבין כיצד נוצרים פערים לאחר שכפול וממלאים את הגנום של התאים האנושיים.
Introduction
עבודות סמינל סיפקו עדויות להצטברות של פערים חד-גדיליים (ssDNA) לאחר שכפול בעת טיפול בחומרים מזיקים לדנ”א בחיידקים1 ובתאים אנושיים 2,3. במהלך שכפול של תבניות דנ”א פגומות, מנגנוני סינתזת הדנ”א עשויים לעקוף את הנגעים על ידי שימוש בפולימראזות DNA ספציפיות של סינתזת טרנסלציה או באמצעות מנגנוני החלפת תבניות. לחלופין, ה-replisome עשוי גם פשוט לדלג על הנגע ולהשאיר מאחור מרווח ssDNA, שיתוקן מאוחר יותר. לאחרונה, מחקר הראה בבירור כי טיפול בחומרים גנוטוקסיים מוביל לפערי ssDNA באאוקריוטים על ידי שימוש במיקרוסקופיית אלקטרונים כדי לדמיין את המבנה הספציפי של מתווכי שכפול4. היווצרותם של אזורים אלה של פערים לאחר שכפול הוצעה בתחילה להיות תוצאה פשוטה של המצב הבלתי רציף למחצה של שכפול DNA2. במקרה זה, נגע על הגדיל המפגר יכול לחסום את התארכותו של שבר אוקזאקי, אך התקדמות המזלג ניצלת באופן טבעי על ידי שבר אוקזאקי הבא, ומשאירה מאחור פער ssDNA. עם זאת, מחקרים נוספים הראו כי היווצרות פערים על הגדיל המוביל אפשרית גם כן, כפי שהוכח לראשונה בחיידק5. באאוקריוטים, PRIMPOL, פולימראז דנ”א ייחודי עם פעילות פרימאז, הוכח כמי שמסוגל להפעיל מחדש את סינתזת הדנ”א במורד הזרם של נגע חוסם שכפול באמצעות פעילות הנזיפה שלו 6,7,8,9,10,11. לפיכך, פעילות הפרימט PRIMPOL עשויה להסביר את היווצרותם של פערי ssDNA לאחר שכפול בגדיל המוביל עם טיפול בחומר מזיק לדנ”א בתאים אנושיים12. עם זאת, זיהוי פערים אלה, כמו גם תיקון פערים, עד לאחרונה, דרשו גישות עקיפות או גוזלות זמן כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים4 או בדיקות מבוססות פלסמיד13. השימוש בנוקלאז S1 הספציפי ל-SsDNA כדי לזהות פערים בתאים אנושיים היה חלוץ במחקרים מוקדמים לפני יותר מארבעים שנה, תוך שימוש בטכניקות גרדיאנט סוכרוז 2,3. לאחרונה, הקבוצה שלנו יישמה את השימוש בנוקלאז זה כדי לזהות ssDNA בשכפול דנ”א (פערים לאחר שכפול) בשיטות אחרות כגון סיבי דנ”א ומבחני שביט14. גישות חדשות אלה סללו את הדרך לגל הנוכחי של מחקרים על פערים שלאחר שכפול. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה של שימוש בנוקלאז S1 כדי לזהות פערי ssDNA לאחר שכפול על ידי בדיקת סיבי DNA ומסבירים כיצד ערכת תיוג דיפרנציאלית בפרוטוקול סיבי הדנ”א יכולה לאפשר מחקר של תיקון פערים אלה.
בדיקת סיבי הדנ”א היא טכניקה רבת עוצמה ששימשה מספר גדל והולך של מעבדות וסיפקה תובנות חשובות על דינמיקת מזלג שכפול ומנגנוני תגובת עקה לשכפול. בקצרה, טכניקה זו מבוססת על שילוב רציף של אנלוגים נוקלאוטידים (כגון CldU -5-chloro-2′-deoxyuridine-, ו- IdU -5-iodo-2′-deoxyuridine) בדנ”א המשכפל. לאחר הקציר, התאים נשחקים, ומולקולות דנ”א מתפשטות על מגלשת זכוכית מצופה באופן חיובי. לאחר מכן, CldU ו-IdU מזוהים על ידי נוגדנים ספציפיים, שאותם ניתן לדמיין במיקרוסקופ פלואורסצנטי כסיבים דו-גוניים. לבסוף, אורכי דרכי IdU ו-CldU נמדדים כדי לזהות שינויים כלשהם בדינמיקה של שכפול הדנ”א כתוצאה מאינדוקציה של נזק לדנ”א. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור תופעות שונות, כגון תקיעת מזלג, האטת מזלג, השפלת דנ”א מתהווה ושינויים בתדירות הירי במקור15,16.
מגבלה אחת של בדיקת סיבי הדנ”א היא הרזולוציה של כמה קילו-בסיסים. מכיוון שפערי ssDNA לאחר שכפול יכולים להיות בטווח של מאות בסיסים, אי אפשר לדמיין את הפערים האלה ישירות על ידי פרוטוקול סיבי הדנ”א הסטנדרטי. נוכחותם של פערי ssDNA על שכפול דנ”א בתאים אנושיים שטופלו בחומרים גנוטוקסיים הייתה מעורבת בעבר בעקיפין. לדוגמה, תצפית של ssDNA כפי שהוערך על ידי גיוס של החלבון הקושר ssDNA, חלבון שכפול A (RPA), בתאים מחוץ לשלב S, או היווצרות של ssDNA כפי שזוהה על ידי הרפיית DNA אלקליין בשילוב עם היעדר עיכוב מזלג ממושך על ידי בדיקת סיבי DNA 12,17,18,19,20,21 יוחסה להצטברות של פערי ssDNA. בנוסף, פערי ssDNA לאחר שכפול גורמים למחסום פאזה G2/M תלוי ATR ותאי מעצר שטופלו ברעלי שכפול 18,19,20,21,22.
הנוקלאז S1 מפרק חומצות גרעין חד-גדיליות המשחררות 5′-פוספוריל מונו- או אוליגונוקלאוטידים ויש לו זיקה גבוהה פי 5 ל-ssDNA בהשוואה לרנ”א. חומצות גרעין דו-גדיליות (DNA:DNA, DNA:RNA, או RNA:RNA) עמידות בפני נוקלאז S1 למעט כאשר משתמשים בהן בריכוזים גבוהים במיוחד. הנוקלאז S1 גם מבקע דנ”א דו-גדילי באזור החד-גדילי הנגרם על-ידי ניק, פער, חוסר התאמה או לולאה. הנוקלאז S1 הוא אפוא אנדונוקלאז ספציפי ל-ssDNA המסוגל לבקוע פערי ssDNA, ובסופו של דבר לייצר שברים דו-גדילייםשל 23,24. לפיכך, הוספת שלבים לעיכול נוקלאז S1 לפרוטוקול סיבי הדנ”א מאפשרת בעקיפין זיהוי של פערי ssDNA לאחר שכפול. בנוכחות פערים, טיפול בגרעינים חשופים עם נוקלאז S1 לפני התפשטות הדנ”א ייצור דרכים קצרות יותר כתוצאה מביקת S1 של ssDNA הנמצאת מטבעה בפערים14. לפיכך, קיצור דרכי הוא הקריאה לפערי ssDNA באמצעות גישה זו. בהשוואה לפרוטוקול סיבי הדנ”א הסטנדרטי, סיבי הדנ”א עם הנוקלאז S1 דורשים רק שני שלבים נוספים: חשיפה גרעינים (חדירת תאים) וטיפול בנוקלאז S1. חשוב לציין כי בקרות מתאימות הן חובה, כגון דגימות המטופלות בחומר הגנוטוקסי אך ללא נוקלאז S1 ודגימות שטופלו בנוקלאז S1 ללא הסוכן הגנוטוקסי. הפרוטוקול עצמו, כולל שילוב אנלוגים, טיפול S1 והתפשטות, יכול להתבצע ביום אחד ואינו דורש חומר יוצא דופן. זה דורש רק את אנלוגי התימידין, את נוקלאז S1 המטוהר, את הנוגדנים הראשוניים והמשניים המתאימים, ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. באופן כללי, סיבי הדנ”א המשתמשים בנוקלאז S1 מזהים פערי ssDNA על מזלגות שכפול מתמשכים באמצעות גישה פשוטה יחסית.
ניתן לתקן (או למלא) את פערי ה-ssDNA שלאחר השכפול שנוצרו כתוצאה ממנגנוני תגובת מתח שכפול על ידי מנגנונים שונים, כולל סינתזת DNA של טרנסלציה או החלפת תבניות, בתהליך שנקרא מילוי פערים או תיקון לאחר שכפול (PRR)25. תהליכים אלה מתרחשים מאחורי הפיצולים המתקדמים, הכוללים סינתזת דנ”א בלתי תלויה בשכפול 14,26,27. בהתבסס על ממצאים אלה, ניתן לבצע ערכת תיוג שונה מבדיקת סיבי הדנ”א הסטנדרטית כדי לדמיין אירועים ממלאי פערים בשלב G2 ישירות 14,16,26,28. באופן ספציפי, ניתן להשתמש באנלוגיית תימידין אחת כדי לתייג את מזלג השכפול בזמן הטיפול הגנוטוקסי והיווצרות פערי ssDNA לאחר שכפול, בעוד שניתן להשתמש באנלוגיה אחרת של תימידין כדי לתייג אירועים של מילוי פערים. בפרוטוקול זה, התאים מסומנים באנלוגיה תימידין ראשונה (IdU, למשל) מיד לאחר או במקביל לטיפול גנוטוקסי במשך שעה אחת, כך שהדנ”א המתהווה מסומן בזמן היווצרות הפער. Nocodazole מתווסף עם הטיפול בכל מקום בין 12-24 שעות כדי לעצור תאים ב-G2/M, ובכך למנוע את שלב ה-S הבא. עבור 4 השעות האחרונות של טיפול בנוקודזול, אנלוגי תימידין שני (CldU, למשל) מתווסף למדיה כדי שישולבו במהלך מילוי הפער. חשוב לציין, ניתן להשתמש בבדיקה זו רק כדי לזהות אירועים של מילוי פערים ב-G2 מכיוון שלא ניתן להבחין בין האות הממלא את הפער מ-CldU לבין אות עקב שילוב CldU בשכפול דנ”א בשלב ה-S. לכן, כדי למזער את אות הרקע, התזמון של שילוב CldU לאחר אינדוקציה של נזק צריך לחפוף עם כאשר רוב אוכלוסיית התאים נכנסת לשלבG2 14. לכן, תזמון זה ישתנה בהתאם לקו התא ולמצבי הטיפול. מומלץ למטב את התקדמות מחזור התאים לפני השימוש בבדיקה זו. צביעה משותפת של אנלוגים תימידין אלה מאפשרת הדמיה של דרכי מילוי פערים (PRR) (טלאי CldU) על גבי דנ”א מתהווה (דרכי IdU) המסונתזות במהלך הטיפול הגנוטוקסי כאשר נוצרו פערי ssDNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים של פרוטוקול בדיקת סיבי הדנ”א הסטנדרטי נדונו בפרסום קודם32. כאן אנו מתארים גרסאות מותאמות של בדיקת סיבי הדנ”א הסטנדרטית כדי לחקור את נוכחותם של פערי ssDNA לאחר שכפול, כמו גם את תיקונם על ידי מילוי פערים, המתוארים לראשונהב-14. בהקשר של נוכחות פער ssDNA לאחר שכ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה במעבדת C.F.M.M. נתמכת על ידי Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, סאו פאולו, ברזיל, מענקים #2019/19435-3, #2013/08028-1 ו-2017/05680-0) במסגרת מחקר שיתוף הפעולה הבינלאומי של FAPESP והארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO, הולנד); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Finance Code 001).
Materials
| Acetic acid, Glacial | Synth | 64-19-7 | Alternatively, BSA – Biosera – REF PM-T1725/100 |
| Ammonium hydroxide | Synth | 1336-21-6 | Or similar |
| Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | – |
| Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470 | – |
| Antibody Mouse anti-BrdU | Becton Disckson | 347580 | – |
| Antibody Rat anti-BrdU | Abcam | Ab6326 | – |
| Biological security hood | Pachane | PA 410 | Use hood present in the laboratory |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | Or similar |
| Cell scraper | Thermo Scientific | 179693 | Or similar |
| CldU | Millipore-Sigma | C6891 | – |
| Cloridric acid | Synth | 7647-01-0 | Or similar |
| Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) | Zeiss | – | Or similar |
| Cover glass (or coverslips) | Thermo Scientific | 152460 | Alternatively, Olen – Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) – K5-2460 |
| DMEM – High Glucose | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | Use culture media specific for the cell line used. |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | E5314 | Or similar |
| Epifluorescence Microscope Axiovert 200 | Zeiss | – | Or similar |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 12657-029 | Or similar |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | Use cell incubator present in the laboratory |
| Glass slide jar | Sigma-Aldrich | S5516 | Or similar |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | Or similar |
| Idu | Millipore-Sigma | I7125 | – |
| Magnesium Chloride | Synth | 7791-18-6 | Or similar |
| Methanol | Merck | 67-56-1 | Or similar |
| Microscope slides | Denville | M1021 | Alternatively, Olen – Kasvi Microscope Slides – K5-7105 OR Precision Glass Line – 7105-1 |
| MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) | Synth | 1132-61-2 | Or similar |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9 | – |
| PBS (Phosphate Buffer Saline) | Life Thechnologies | 3002 | Or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Or similar |
| ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used |
| S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 – 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | BioRad | 161-0302 | Or similar |
| Sodium Acetate Trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | Or similar |
| Sodium Chloride | Synth | 7647-14-5 | Or similar |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | Or similar |
| Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | Or similar |
| Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | Or similar |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Or similar |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Or similar |
| UVC Lamp | Non Specific | – | Essential: emission lenght of 254 nm |
| VLX-3W UV Radiometer | Vilber Loumart | – | Or similar |
| Zinc Acetate | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Or similar |
Referencias
- Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
- Meneghini, R. Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells. Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).
- Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light. Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).
- Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions. Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).
- Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).
- Bianchi, J., et al. PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication. Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).
- García-Gómez, S., et al. PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells. Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).
- Mourón, S., et al. Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).
- Wan, L., et al. hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity. EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).
- Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol. Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. PRIMPOL ready, set, reprime. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).
- Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells. Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).
- Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z., Bjergbæk, L. Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells. DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 920, (2012).
- Quinet, A., et al. Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
- Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts. Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).
- Diamant, N., et al. DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity. Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).
- Temviriyanukul, P., et al. Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome. DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).
- Jansen, J. G., et al. Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).
- Quinet, A., et al. Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome. DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).
- Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).
- Vogt, V. M. Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae. European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).
- Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells. Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).
- Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models. DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).
- Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication. Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).
- Karras, G. I., Jentsch, S. The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase. Cell. 141 (2), 255-267 (2010).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Quinet, A., et al. PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells. Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).
- Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells. Genes & Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Lim, K. S., et al. USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors. Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).
- Peng, M., et al. Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress. Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).
- Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating in vitro DNA damage using comet assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).
