Rilevamento di lacune post-replicative accumulo e riparazione nelle cellule umane utilizzando il test delle fibre di DNA
Summary
Qui descriviamo due modifiche del test della fibra di DNA per studiare le lacune del DNA a singolo filamento nella replicazione del DNA dopo l’induzione della lesione. Il test della fibra S1 consente il rilevamento di lacune post-replicative utilizzando l’endonucleasi S1 specifica per ssDNA, mentre il test di riempimento delle lacune consente la visualizzazione e la quantificazione della riparazione del gap.
Abstract
Il test della fibra di DNA è un metodo semplice e robusto per l’analisi della dinamica della forcella di replicazione, basato sull’immunodetezione di analoghi nucleotidici che vengono incorporati durante la sintesi del DNA nelle cellule umane. Tuttavia, questa tecnica ha una risoluzione limitata di poche migliaia di kilobasi. Di conseguenza, le lacune post-replicative del DNA a singolo filamento (ssDNA) piccole come poche centinaia di basi non sono rilevabili dal test standard. Qui, descriviamo una versione modificata del test della fibra di DNA che utilizza la nucleasi S1, un enzima che scinde specificamente l’ssDNA. In presenza di gap ssDNA post-replicativi, la nucleasi S1 prenderà di mira e fenderà i gap, generando tratti più corti che possono essere utilizzati come read-out per gli ssDNA gaps sulle forche in corso. Queste lacune post-replicative di ssDNA si formano quando il DNA danneggiato viene replicato in modo discontinuo. Possono essere riparati tramite meccanismi disaccoppiati dalla replicazione del genoma, in un processo noto come gap-filling o riparazione post-replicativa. Poiché i meccanismi di riempimento delle lacune coinvolgono la sintesi del DNA indipendentemente dalla fase S, le alterazioni nello schema di etichettatura delle fibre di DNA possono anche essere impiegate per monitorare gli eventi di riempimento delle lacune. Complessivamente, queste modifiche del test delle fibre di DNA sono potenti strategie per capire come si formano e si riempiono le lacune post-replicative nel genoma delle cellule umane.
Introduction
Lavori seminali hanno fornito prove dell’accumulo di lacune post-replicative a singolo filamento (ssDNA) durante il trattamento con agenti dannosi per il DNA nei batteri1 e nelle cellule umane 2,3. Durante la replicazione di modelli di DNA danneggiati, il meccanismo di sintesi del DNA può bypassare le lesioni impiegando specifiche DNA polimerasi di sintesi translesionale o attraverso meccanismi di commutazione del modello. In alternativa, il replisome può anche semplicemente saltare la lesione lasciando dietro di sé un gap di ssDNA, da riparare in seguito. Più recentemente, uno studio ha mostrato chiaramente che il trattamento con agenti genotossici porta a lacune di ssDNA negli eucarioti utilizzando la microscopia elettronica per visualizzare la struttura specifica degli intermedi di replicazione4. La formazione di queste regioni di lacune post-replicative è stata inizialmente proposta come un semplice risultato della modalità semi-discontinua di replicazione del DNA2. In questo caso, una lesione sul filamento in ritardo può bloccare l’allungamento di un frammento di Okazaki, ma la progressione della forcella viene naturalmente salvata dal successivo frammento di Okazaki, lasciando dietro di sé un gap di ssDNA. Tuttavia, ulteriori studi hanno dimostrato che è anche possibile la formazione di lacune sul filamento principale, come dimostrato per la prima volta nei batteri5. Negli eucarioti, PRIMPOL, una DNA polimerasi unica con attività primasi, ha dimostrato di essere in grado di riavviare la sintesi del DNA a valle di una lesione che blocca la replicazione attraverso la sua attività di rimprovero 6,7,8,9,10,11. Pertanto, l’attività primasi di PRIMPOL può spiegare la formazione di lacune post-replicative di ssDNA nel filamento principale dopo il trattamento con un agente dannoso per il DNA nelle cellule umane12. Tuttavia, il rilevamento di queste lacune e la riparazione delle lacune, fino a poco tempo fa, richiedevano approcci indiretti o dispendiosi in termini di tempo come la microscopia elettronica4 o i saggi basati su plasmidi13. L’uso della nucleasi S1 specifica per ssDNA per rilevare le lacune nelle cellule umane è stato sperimentato dai primi studi più di quarant’anni fa, utilizzando tecniche di gradiente di saccarosio 2,3. Più recentemente, il nostro gruppo ha applicato l’uso di questa nucleasi per rilevare l’ssDNA nella replicazione del DNA (lacune post-replicative) utilizzando altri metodi come la fibra di DNA e i saggi delle comete14. Questi nuovi approcci hanno spianato la strada all’attuale ondata di studi sulle lacune post-replicative. Qui, descriviamo una strategia di utilizzo della nucleasi S1 per rilevare le lacune post-replicative di ssDNA mediante il test della fibra di DNA e spieghiamo come uno schema di etichettatura differenziale nel protocollo della fibra di DNA può consentire lo studio della riparazione di queste lacune.
Il test della fibra di DNA è una tecnica potente che è stata utilizzata da un numero crescente di laboratori e ha fornito preziose informazioni sulle dinamiche della forcella di replicazione e sui meccanismi di risposta allo stress di replicazione. In breve, questa tecnica si basa sull’incorporazione sequenziale di analoghi nucleotidici (come CldU -5-cloro-2′-deossiuridina-, e IdU -5-iodo-2′-deossiuridina) nel DNA replicante. Dopo la raccolta, le cellule vengono lisate e le molecole di DNA si diffondono su un vetrino rivestito positivamente. CldU e IdU vengono quindi rilevati da anticorpi specifici, che possono essere visualizzati in un microscopio fluorescente come fibre bicolori. Infine, le lunghezze dei tratti IdU e CldU vengono misurate per identificare eventuali alterazioni delle dinamiche di replicazione del DNA come conseguenza dell’induzione del danno al DNA. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare diversi fenomeni, come lo stallo della forcella, il rallentamento della forcella, la degradazione del DNA nascente e le variazioni nella frequenza di sparo di origine15,16.
Una limitazione del test della fibra di DNA è la sua risoluzione di poche kilobasi. Poiché le lacune post-replicative di ssDNA possono essere nell’intervallo di centinaia di basi, è impossibile visualizzare queste lacune direttamente dal protocollo standard della fibra di DNA. La presenza di lacune di ssDNA sulla replicazione del DNA in cellule umane trattate con agenti genotossici è stata indirettamente implicata in precedenza. Ad esempio, l’osservazione di ssDNA valutata mediante reclutamento della proteina legante ssDNA, della proteina di replicazione A (RPA), in cellule al di fuori della fase S, o la formazione di ssDNA rilevata dallo svolgimento del DNA alcalino combinata con l’assenza di stallo prolungato della forcella mediante test della fibra di DNA 12,17,18,19,20,21 è stato attribuito all’accumulo di lacune ssDNA. Inoltre, le lacune post-replicative di ssDNA inducono un checkpoint di fase G2/M dipendente dall’ATR e arrestano le cellule trattate con veleni replicanti 18,19,20,21,22.
La nucleasi S1 degrada gli acidi nucleici a singolo filamento rilasciando 5′-fosforile mono- o oligonucleotidi e ha un’affinità 5 volte superiore all’ssDNA rispetto all’RNA. Gli acidi nucleici a doppio filamento (DNA:DNA, DNA:RNA o RNA:RNA) sono resistenti alla nucleasi S1 tranne se usati in concentrazioni estremamente elevate. La nucleasi S1 fende anche il DNA a doppio filamento nella regione a singolo filamento causato da un nick, gap, mismatch o loop. La nucleasi S1 è quindi un’endonucleasi specifica per ssDNA in grado di scindere le lacune ssDNA, generando infine rotture a doppio filamento23,24. Pertanto, l’aggiunta di passaggi per la digestione della nucleasi S1 al protocollo della fibra di DNA consente indirettamente il rilevamento di lacune post-replicative di ssDNA. In presenza di lacune, il trattamento dei nuclei esposti con la nucleasi S1 prima della diffusione del DNA genererà tratti più corti come conseguenza della scissione S1 di ssDNA intrinsecamente presente nelle lacune14. Di conseguenza, l’accorciamento del tratto è la lettura per le lacune ssDNA utilizzando questo approccio. Rispetto al protocollo standard della fibra di DNA, la fibra di DNA con la nucleasi S1 richiede solo due passaggi aggiuntivi: l’esposizione ai nuclei (permeabilizzazione cellulare) e il trattamento con la nucleasi S1. È importante notare che sono obbligatori controlli appropriati, come i campioni trattati con l’agente genotossico ma senza la nucleasi S1 e i campioni trattati con la nucleasi S1 senza l’agente genotossico. Il protocollo stesso, compresa l’incorporazione di analoghi, il trattamento S1 e la diffusione, può essere eseguito in un giorno e non richiede materiale eccezionale. Richiede solo gli analoghi della timidina, la nucleasi S1 purificata, gli anticorpi primari e secondari appropriati e un microscopio fluorescente. Nel complesso, la fibra di DNA che impiega la nucleasi S1 rileva le lacune di ssDNA sulle forche di replicazione in corso utilizzando un approccio relativamente semplice.
Le lacune post-replicative di ssDNA formate come conseguenza dei meccanismi di risposta allo stress di replicazione possono essere riparate (o riempite) da diversi meccanismi, tra cui la sintesi del DNA translesionale o la commutazione del modello, in un processo chiamato gap-filling o post-replication repair (PRR)25. Questi processi avvengono dietro le forche che avanzano, coinvolgendo la sintesi del DNA indipendente dalla replicazione 14,26,27. Sulla base di questi risultati, è possibile eseguire uno schema di etichettatura distinto dal test standard della fibra di DNA per visualizzare gli eventi di riempimento delle lacune nella fase G2 direttamente 14,16,26,28. In particolare, un analogo della timidina può essere utilizzato per etichettare la forcella di replicazione al momento del trattamento genotossico e della formazione post-replicativa del gap ssDNA, mentre un altro analogo della timidina può essere utilizzato per etichettare gli eventi di riempimento del gap. In questo protocollo, le cellule vengono etichettate con un primo analogo della timidina (IdU, ad esempio) immediatamente dopo o in concomitanza con un trattamento genotossico per 1 ora, in modo che il DNA nascente sia etichettato al momento della formazione del gap. Nocodazolo viene aggiunto durante il trattamento per un periodo compreso tra 12-24 ore per arrestare le cellule in G2 / M, prevenendo la successiva fase S. Per le ultime 4 ore di trattamento con nocodazolo, un secondo analogo della timidina (CldU, ad esempio) viene aggiunto al mezzo da incorporare durante il riempimento del gap. È importante sottolineare che questo test può essere utilizzato solo per rilevare eventi di riempimento del gap in G2 perché il segnale di riempimento del gap da CldU non può essere distinto da un segnale a causa dell’incorporazione di CldU nel DNA replicante nella fase S. Pertanto, per ridurre al minimo il segnale di fondo, i tempi di incorporazione di CldU dopo l’induzione del danno dovrebbero coincidere con quando la maggior parte della popolazione cellulare sta entrando nella fase G214. Pertanto, questa tempistica varierà a seconda della linea cellulare e delle condizioni di trattamento. Si consiglia di ottimizzare la progressione del ciclo cellulare prima di utilizzare questo test. La co-colorazione di questi analoghi della timidina consente la visualizzazione di tratti di riempimento del gap (PRR) (cerotti CldU) sopra il DNA nascente (tratti IdU) sintetizzato durante il trattamento genotossico quando sono stati generati spazi vuoti di ssDNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi critici del protocollo standard di analisi delle fibre di DNA sono stati discussi in una precedente pubblicazione32. Qui, descriviamo le versioni modificate del test standard delle fibre di DNA per studiare la presenza di lacune post-replicative di ssDNA e la loro riparazione mediante gap-filling, inizialmente descritto in14. Nel contesto della presenza post-replicativa di ssDNA gap, l’uso della nucleasi S1 nel protocollo S1 Fiber sarebbe molto probabilmente adat…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro nel laboratorio C.F.M.M. è supportato dalla Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brasile, Grants #2019/19435-3, #2013/08028-1 e 2017/05680-0) nell’ambito dell’International Collaboration Research di FAPESP e The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO, Paesi Bassi); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brasile, Grants # 308868/2018-8] e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brasile, Finance Code 001).
Materials
| Acetic acid, Glacial | Synth | 64-19-7 | Alternatively, BSA – Biosera – REF PM-T1725/100 |
| Ammonium hydroxide | Synth | 1336-21-6 | Or similar |
| Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | – |
| Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470 | – |
| Antibody Mouse anti-BrdU | Becton Disckson | 347580 | – |
| Antibody Rat anti-BrdU | Abcam | Ab6326 | – |
| Biological security hood | Pachane | PA 410 | Use hood present in the laboratory |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | Or similar |
| Cell scraper | Thermo Scientific | 179693 | Or similar |
| CldU | Millipore-Sigma | C6891 | – |
| Cloridric acid | Synth | 7647-01-0 | Or similar |
| Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) | Zeiss | – | Or similar |
| Cover glass (or coverslips) | Thermo Scientific | 152460 | Alternatively, Olen – Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) – K5-2460 |
| DMEM – High Glucose | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | Use culture media specific for the cell line used. |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | E5314 | Or similar |
| Epifluorescence Microscope Axiovert 200 | Zeiss | – | Or similar |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 12657-029 | Or similar |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | Use cell incubator present in the laboratory |
| Glass slide jar | Sigma-Aldrich | S5516 | Or similar |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | Or similar |
| Idu | Millipore-Sigma | I7125 | – |
| Magnesium Chloride | Synth | 7791-18-6 | Or similar |
| Methanol | Merck | 67-56-1 | Or similar |
| Microscope slides | Denville | M1021 | Alternatively, Olen – Kasvi Microscope Slides – K5-7105 OR Precision Glass Line – 7105-1 |
| MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) | Synth | 1132-61-2 | Or similar |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9 | – |
| PBS (Phosphate Buffer Saline) | Life Thechnologies | 3002 | Or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Or similar |
| ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used |
| S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 – 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | BioRad | 161-0302 | Or similar |
| Sodium Acetate Trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | Or similar |
| Sodium Chloride | Synth | 7647-14-5 | Or similar |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | Or similar |
| Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | Or similar |
| Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | Or similar |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Or similar |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Or similar |
| UVC Lamp | Non Specific | – | Essential: emission lenght of 254 nm |
| VLX-3W UV Radiometer | Vilber Loumart | – | Or similar |
| Zinc Acetate | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Or similar |
Referencias
- Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
- Meneghini, R. Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells. Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).
- Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light. Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).
- Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions. Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).
- Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).
- Bianchi, J., et al. PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication. Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).
- García-Gómez, S., et al. PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells. Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).
- Mourón, S., et al. Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).
- Wan, L., et al. hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity. EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).
- Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol. Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. PRIMPOL ready, set, reprime. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).
- Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells. Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).
- Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z., Bjergbæk, L. Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells. DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 920, (2012).
- Quinet, A., et al. Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
- Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts. Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).
- Diamant, N., et al. DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity. Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).
- Temviriyanukul, P., et al. Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome. DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).
- Jansen, J. G., et al. Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).
- Quinet, A., et al. Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome. DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).
- Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).
- Vogt, V. M. Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae. European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).
- Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells. Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).
- Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models. DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).
- Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication. Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).
- Karras, G. I., Jentsch, S. The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase. Cell. 141 (2), 255-267 (2010).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Quinet, A., et al. PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells. Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).
- Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells. Genes & Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Lim, K. S., et al. USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors. Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).
- Peng, M., et al. Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress. Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).
- Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating in vitro DNA damage using comet assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).
