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Medio ambiente

Bioprospezione dei microrganismi estremofili per affrontare l'inquinamento ambientale

Published: December 30, 2021
doi:
10.3791/63453
, , , , ,
1Department of Biology,University of Naples Federico II, 2Institute of Polymers, Composites and Biomaterials (IPCB),Consiglio Nazionale delle Ricerche CNR, 3Division of Biological Systems and Engineering,Lawrence Berkeley National Laboratory, 4BAT Center-Interuniversity Center for Studies on Bioinspired Agro-Environmental Technology,University of Napoli Federico II

Summary

L’isolamento di microbi resistenti ai metalli pesanti dalle sorgenti geotermiche è un argomento caldo per lo sviluppo di biosistemi di biorisanamento e monitoraggio ambientale. Questo studio fornisce un approccio metodologico per isolare e identificare i batteri tolleranti ai metalli pesanti dalle sorgenti termali.

Abstract

Le sorgenti geotermiche sono ricche di vari ioni metallici a causa dell’interazione tra roccia e acqua che avviene nella falda acquifera profonda. Inoltre, a causa della variazione stagionale del pH e della temperatura, la fluttuazione della composizione degli elementi viene periodicamente osservata all’interno di questi ambienti estremi, influenzando le comunità microbiche ambientali. I microrganismi estremofili che prosperano nelle bocche termiche vulcaniche hanno sviluppato meccanismi di resistenza per gestire diversi ioni metallici presenti nell’ambiente, prendendo così parte a complessi cicli biogeochimici metallici. Inoltre, gli estremofili e i loro prodotti hanno trovato un ampio punto d’appoggio nel mercato, e questo vale soprattutto per i loro enzimi. In questo contesto, la loro caratterizzazione è funzionale allo sviluppo di biosistemi e bioprocessi per il monitoraggio ambientale e il biorisanamento. Ad oggi, l’isolamento e la coltivazione in condizioni di laboratorio di microrganismi estremofili rappresentano ancora un collo di bottiglia per sfruttare appieno il loro potenziale biotecnologico. Questo lavoro descrive un protocollo semplificato per l’isolamento di microrganismi termofili da sorgenti termali e la loro identificazione genotipica e fenotipica attraverso le seguenti fasi: (1) Campionamento di microrganismi da siti geotermici (“Pisciarelli”, un’area vulcanica dei Campi Flegrei a Napoli, Italia); (2) Isolamento di microrganismi resistenti ai metalli pesanti; (3) Identificazione di isolati microbici; (4) Caratterizzazione fenotipica degli isolati. Le metodologie descritte in questo lavoro potrebbero essere generalmente applicate anche per l’isolamento di microrganismi provenienti da altri ambienti estremi.

Introduction

Gli ambienti estremi del nostro pianeta sono eccellenti fonti di microrganismi in grado di tollerare condizioni difficili (cioè temperatura, pH, salinità, pressione e metalli pesanti)1,2, essendo Islanda, Italia, STATI UNITI, Nuova Zelanda, Giappone, Africa centrale e India, le aree vulcaniche più riconosciute e studiate 3,4,5,6,7,8,9 . I termofili si sono evoluti in ambienti difficili in un intervallo di temperature da 45 °C a 80 °C 10,11,12. I microrganismi termofili, appartenenti al regno archeale o batterico, sono un serbatoio per lo studio della biodiversità, della filogenesi e della produzione di biomolecole esclusive per applicazioni industriali 13,14,15,16. Infatti, negli ultimi decenni, la continua domanda industriale nel mercato globale ha favorito lo sfruttamento di estremofili e termoenzimi per le loro applicazioni diversificate in diversi campi biotecnologici 17,18,19.

Le sorgenti termali, dove gli organismi vivono in consorzi, sono ricche fonti di biodiversità, rappresentando quindi un habitat attraente per studiare l’ecologia microbica20,21. Inoltre, queste aree vulcaniche ricche di metalli sono comunemente colonizzate da microrganismi che hanno evoluto sistemi di tolleranza per sopravvivere e adattarsi alla presenza di metalli pesanti22,23 e sono quindi attivamente coinvolti nei loro cicli biogeochimici. Al giorno d’oggi, i metalli pesanti sono considerati inquinanti prioritari per l’uomo e l’ambiente. I microrganismi resistenti ai metalli pesanti sono in grado di solubilizzare e precipitare i metalli trasformandoli e rimodellando i loro ecosistemi24,25. La comprensione dei meccanismi molecolari della resistenza ai metalli pesanti è un argomento caldo per l’urgenza di sviluppare nuovi approcci verdi 26,27,28. In questo contesto, la scoperta di nuovi batteri tolleranti rappresenta il punto di partenza per lo sviluppo di nuove strategie per il biorisanamento ambientale24,29. Accompagnando gli sforzi per esplorare gli ambienti idrotermali attraverso procedure microbiologiche e aumentare le conoscenze sul ruolo dei geni alla base della tolleranza ai metalli pesanti, è stato condotto uno screening microbico nell’area termale dei Campi Flegrei in Italia. Questo ambiente ricco di metalli pesanti mostra una potente attività idrotermale, fumarole e piscine bollenti, variabili in pH e temperatura in dipendenza della stagionalità, delle precipitazioni e dei movimenti geologici sotterranei30. In questa prospettiva, descriviamo un modo facile da applicare ed efficace per isolare batteri resistenti ai metalli pesanti, ad esempio, Geobacillus stearothermophilus GF1631 (denominato isolato 1) e Alicyclobacillus mali FL1832 (denominato isolato 2) dalla zona di Pisciarelli dei Campi Flegrei.

Protocol

1. Campionamento di microrganismi da siti geotermici Scegliere il sito per il campionamento utilizzando come criterio i luoghi con la temperatura e il pH desiderati. Misurare i parametri fisici attraverso una sonda termocoppia digitale, inserendola nelle piscine o nei fanghi selezionati. Raccogliere 20 g di campioni di terreno (in questo caso, dal fango nel sito idrotermale di Pisciarelli Solfatara), raccogliendoli con un cucchiaio sterilizzato. Prelevare almeno due campioni per ogni …

Representative Results

Sito di campionamentoQuesto protocollo illustra un metodo per l’isolamento di batteri resistenti ai metalli pesanti da una sorgente calda. In questo studio, l’area di Pisciarelli, un ambiente geotermico acido-solfidico, è stata utilizzata come sito di campionamento (Figura 1). Questo ecosistema è caratterizzato dal flusso di fluidi solforosi aggressivi derivati da attività vulcaniche. È stato dimostrato che le comunità microbiche nei sistemi geoterm…

Discussion

Le sorgenti termali contengono una diversità non sfruttata di microbiomi con capacità metaboliche altrettanto diverse12. Lo sviluppo di strategie per l’isolamento di microrganismi in grado di convertire efficacemente i metalli pesanti in composti meno tossici10 rappresenta un’area di ricerca di crescente interesse a livello mondiale. Questo documento mira a descrivere un approccio semplificato per lo screening e l’isolamento dei microbi con la capacità di resistere alle …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da ERA-NET Cofund MarTERA: “FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing”, PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 e da GoodbyWaste: ObtainGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italia. Si ringraziano la Dott.ssa Monica Piochi e la Dott.ssa Angela Mormone (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italia) per l’identificazione e la caratterizzazione del sito geotermico.

Materials

Ampicillin Sigma Aldrich A9393
Aura Mini bio air s.c.r.l. Biological hood
Bacitracin Sigma Aldrich B0125
Cadmium chloride Sigma Aldrich 202908
Chloramphenicol Sigma Aldrich C0378
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850
Cobalt chloride Sigma Aldrich C8661
Copper chloride Sigma Aldrich 224332
Erythromycin Sigma Aldrich E5389
Exernal Service DSMZ Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
Genomic DNA Purification Kit Thermo Scientific #K0721
Kanamycin sulphate Sigma Aldrich 60615
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE4000
Mercury chloride Sigma Aldrich 215465
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific
Nickel chloride Sigma Aldrich 654507
Orion Star A221 Portable pH Meter Thermo Scientific STARA2218
Sodium (meta) arsenite Sigma Aldrich S7400
Sodium arsenate dibasic heptahydrate Sigma Aldrich A6756
Sodium chloride Sigma Aldrich S5886
Streptomycin Sigma Aldrich S6501
Tetracycline Sigma Aldrich 87128
Tryptone BioChemica Applichem Panreac A1553
Vancomycin Sigma Aldrich PHR1732
Yeast extract for molecular biology Applichem Panreac  A3732
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Referencias

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Keywords: BioprospectingExtremophilic MicroorganismsEnvironmental PollutionHeavy Metal ResistanceBiosensingBioremediationGeothermal SpringsLuria-Bertani MediumPHTemperatureGrowth ProfileBacterial Lysis Buffer
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Gallo, G., Aulitto, M., Contursi, P., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Bioprospecting of Extremophilic Microorganisms to Address Environmental Pollution. J. Vis. Exp. (178), e63453, doi:10.3791/63453 (2021).
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